奶牛乙型肝炎ＰＣＲ快速诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种奶牛乙型肝炎ＰＣＲ快速诊断试剂盒，它包括４０μＬ等体积混合的引物Ｐ１、Ｐ２，引物Ｐ１、Ｐ２的浓度均为２０μＭ，４０μＬ等体积混合的引物Ｐ３、Ｐ４，引物Ｐ３、Ｐ４的浓度均为２０μＭ，缓冲液６００μＬ，阴性对照２０μＬ，ＰＣＲ酶２５０μＬ，超纯水１７０μＬ，５０μＬ的ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００以及阳性对照２０μＬ。本发明专利技术采用ＰＣＲ对样品进行检测，通过检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测样品中所含有的奶牛乙型肝炎病毒的目的。本发明专利技术检测结果准确、特异，检测方式简单，使用效果好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种试剂盒，尤其是一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎是一种全球性传染性疾病，我国是乙肝病毒感染的高发地区，人类HBsAg 阳性率平均为10. 1%， HBV是对人类健康危害最严重的病毒之一，长期以来人们普遍认为 病毒只感染人和黑猩猩，而不感染其它动物。但近年来兽医学界有关畜禽感染HBV的报道 日益增多。国内很多学者在牛、羊、猪和家禽等多种动物血清中检测出人乙型肝炎病毒表面 抗原和核心抗原。乙肝病毒属于嗜肝DNA病毒，它的基因组为3.2kb。由双链的环状DNA组 成，含有4个开读框分别编码乙肝病毒的表面蛋白S、核蛋白C、反转录酶P和X蛋白。S基 因位于核甘酸第155 833位，编码226个蛋白，由于S基因编码的HBsAg可以诱导保护性 抗体的产生，是乙型肝炎疫苗的主要成分，也是诊断HBV感染的主要依据之一，所以乙型肝 炎病毒S基因及表面抗原与临床的关系的研究一直是国内外关注的热点。ELISA HBV法检 测血清免疫学标志物在临床上得到了广泛应用，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后 显得极为重要。目前关于人HBV检测技术的研究报道较多，而奶牛类HBV的PCR诊断方法 未见报道，因此急需快速、准确、特异的奶牛乙型肝炎诊断试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它可以在快速检 测到乙型肝炎病毒，并且准确、特异。 本专利技术是这样实现的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它包括40 ii L等体积混 合的引物P1 、 P2，引物P1 、 P2的浓度均为20 ii M， 40 ii L等体积混合的引物P3、 P4，引物P3、 P4的浓度均为20 ii M，缓冲液600 ii L，阴性对照20 y L， PCR酶250 y L，超纯水170 y L， 50 y L 的MarkerDL2000以及阳性对照20 y L。 缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。 阴性对照为超纯水。 阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。 PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1. 5mM的MgCL2以及0. 05U的 Poymerase/uL。 弓| 物P1、P2的序歹lj 分另U 为Pl :5' —GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3'， P2 :5， -ACCACTGAACAAATGGCACT-3，。 引物P3、 P4的序列分别为P3 : 5' -ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3 ， ， P4 :5' -AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3'。 套式PCR的建立 套式PCR反应在25iiL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55t:， Taq DNApolymeraselU，引物浓度1Oiimol/L能有效扩增出了其目的片段，分别为509bp、240bp，引物间无非特异性片段产生(见图1)。结果表明奶牛乙肝套式PCR检测方法建立成功。 敏感性试验 应用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒从奶牛血清中提取的奶牛类HBV病毒 DNA，用蛋白质核酸仪测定浓度后，经5倍系列稀释的病毒核酸用于套式PCR敏感性试验。 第一次PCR扩增产物在509bp附近有DNA亮带，奶牛类HBV模板最低检测量为lpg(见图 2)。在509bp附近没有DNA亮带，以第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR扩增，产物在 240bp附近有DNA亮带，结果建立的奶牛类HBV病毒套式PCR能检测到初始模板0. 32fg的 病毒(见图3)。结果表明建立的PCR敏感性高。 特异性试验 以人HBV、奶牛类HBV、 CBPP、 TB， BVDV反转录为cDNA为模板，应用引物P_l、 P_l、 P-2、 P-3、 P-4分别进行第1次PCR扩增和套式PCR反应。结果，以人HBV、奶牛类HBV DNA 均扩增出各病毒的特异性条带，以BVDV、CBPP、TB为模板分别进行套式PCR反应均未扩增出 条带(见图4、图5)。结果表明建立的PCR特异性强。 试剂盒的保存期检测 将试剂盒保存在4°C 、_20°C分别于1月、3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，4°C 保存1年条带较淡，_201:保存1月、3月、6月、1年条带亮度无影响。 根据GenBank中人HBV S基因，设计了 2对引物，通过对PCR反应条件进行优化， 建立了检测奶牛类HBV的套式PCR诊断方法。结果表明，该方法第1次PCR扩增的敏感性 是lpg，第2次PCR敏感性是0. 32fg，扩增产物分别为509bp、240bp，而牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、牛传染性胸膜肺炎(CBPP)、牛结核杆菌(TB)的扩增结果均为阴性。本试剂盒具有 很好的特异性，其敏感性比常规PCR(第1次PCR)提高了 5M咅，为兽医临床诊断奶牛类HBV 提供一种快速、准确的方法，并为开展大规模的奶牛类HBV流行病学调查与疫情监测提供 技术依据。同时目前未见奶牛类HBV病毒大量培养的报道，奶牛类HBV难以获得大量病原 体。本研究得到HBV-S质粒作为PCR的阳性模板，用于临床检测具有很高的安全性和应用 价值。 由于采用了上述技术方案，本专利技术采用PCR对样品进行检测，通过检测结果与阴 性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测样品中所含有的奶牛乙型 肝炎病毒的目的。本专利技术检测结果准确、特异，检测方式简单，使用效果好。附图说明 附图1为HBV套式PCR电泳结果；M :DL2000分子质量标准；1 :人HBV PCR产物；2 :奶牛HBV PCR产物；3 :人HBV PCR 产物；4 :奶牛HBV PCR产物；5 :空白水对照。 附图2为第1次PCR扩增的敏感试验；M :DL2000分子质量标准；1 :奶牛HBV PCR产物2 :空白水对照；3 9 : 5—1 5—7稀释的病毒DNA PCR结果。 附图3为第2次PCR扩增的敏感试验； M :DL2000分子质量标准；1 :奶牛HBV PCR产物2 :空白水对照；3 9 : 5—7 5—12 稀释的病毒DNA PCR结果； 附图4为第1次PCR扩增的特异性试验；M :DL2000分子质量标准;1 :人HBV PCR产物;2 :奶牛HBV PCR产物;3 :BVDV PCR产物;4 :CBPP PCR产物;5 :TB PCR产物;6 :阴性对照; 附图5为第1次PCR扩增的特异性试验；M :DL2000分子质量标准;1 :人HBV PCR产物;2 :奶牛HBV PCR产物;3 :BVDV PCR产物;4 :CBPP PCR产物;5 :TB PCR产物;6 :阴性对照。 具体实施例方式具体实施例方式奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它包括40 L等体积 混合的引物Pl、 P2，引物Pl、 P2的序列分别为PI :5' -GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3'， P2 :5， -ACCACTGAACAAATGGCACT-3'，引物Pl、 P2的浓度均为20 ii M， 40 ii L等体积混 合的引物P3、 P4，引物P3、 P4的序列分另U为P3 :5' -ACCAAGGTATG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛乙型肝炎ＰＣＲ快速诊断试剂盒，其特征在于：它包括４０μＬ等体积混合的引物Ｐ１、Ｐ２，引物Ｐ１、Ｐ２的浓度均为２０μＭ，４０μＬ等体积混合的引物Ｐ３、Ｐ４，引物Ｐ３、Ｐ４的浓度均为２０μＭ，缓冲液６００μＬ，阴性对照２０μＬ，ＰＣＲ酶２５０μＬ，超纯水１７０μＬ，５０μＬ的ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００以及阳性对照２０μＬ。

【技术特征摘要】
一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于它包括40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，40μL等体积混合的引物P3、P4，引物P3、P4的浓度均为20μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。2. 根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于缓冲液为 50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。3. 根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于阴性对照 为超纯水。4. 根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于阳性对照 为重组pMD18-T-HBV-S质粒。5. 根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭诗文，蔡一鸣，余波，冉懋韬，艾玉萍，
申请(专利权)人：贵州省畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]