【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞生物学以及医药生物工程，具体涉及人多能干细胞分化为自然杀伤细胞及其制备方法及其应用。
技术介绍
1、多能干细胞(pluripotent stem cells，pscs)包括胚胎干细胞(escs)以及诱导多能干细胞(ipscs)，是一类具有无限增殖潜能、分化成不同细胞组织、易于进行基因修饰的细胞，当前已成为科研和药物开发的热点。
2、自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)是先天免疫系统的主力军，其来源广泛，如外周血、脐带血、胚胎干细胞、人多能干细胞(hpscs)和nk细胞系。不同来源的nk细胞有着各自的优势和缺陷，其中原代nk细胞可以经历的细胞分裂数量有限，很难扩增为输注所需的大量细胞，且不同供体nk细胞质量差异大，致使难以形成标准化产品；而由hpscs分化获得的nk细胞可以提供稳定的、大批量的细胞，且细胞产品在活性、细胞表型、纯度、无菌等方面均能达到标准。因此在体外从hpscs大规模标准化制备nk细胞，是nk细胞产品成药的有效的解决途径，具有十分重要的应用前景。目前，nk细胞在血液瘤中的研究包括急性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤(mm)等，在实体瘤中的研究包括前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小细胞肺癌等。已有研究结果表明，nk细胞的使用与细胞因子释放综合征(crs)、神经毒性和植物抗宿主病(gvhd)的发生无关，炎症细胞因子(包括il-3，il-6)的水平也没有增加。
3、但现有技术中人多能干细胞分化获得nk细胞体系存在以下一些问题：(1)使用了成分不明确的昂贵的商
4、因此，亟需开发一种快速高效、成本较低且易于工业化大规模生产的nk细胞分化方法，为nk细胞适用于临床治疗提供基础。
技术实现思路
1、本专利技术开发了一种从人多能干细胞通过诱导分化产生nk细胞的方法，通过该方法所生成的免疫细胞，在临床应用上具有很大的优势，具体体现如下：1、低免疫排斥反应，不会发生移植物抗宿主病；2、能快速修复骨髓抑制现象，使血项恢复正常；3、抗放射反应能力强；4、提升免疫及造血功能；5、受体内植入率高，病灶处归巢迅速；6、静脉注射能很容易被患者接受。因此本专利技术所生成的免疫细胞可以通过稳定的规模化生产而尽快进入临床使用。
2、第一方面，本专利技术提供了一种快速高效、成本较低且易于工业化大规模临床生产的人多能干细胞诱导分化为nk细胞的方法，所述方法使用了特定的小分子化合物和细胞因子的组合。所述方法包括在诱导分化期间对拟胚体(embryoid bodies；eb)进行悬浮培养。
3、第二方面，本专利技术提供了通过上述第一方面的方法分化而得的nk细胞或包含nk细胞的细胞培养物。
4、第三方面，本专利技术提供了用于第一方面的方法的nk细胞分化培养基和nk细胞扩增培养基。
5、第四方面，本专利技术提供了上述第二方面的nk细胞或包含nk细胞的细胞培养物或其衍生物作为药物的应用。
6、第五方面，本专利技术提供了一种基因修饰的nk细胞，其通过第一方面的方法从经过基因修饰的人多能干细胞获得。
7、第六方面，本专利技术提供一种药物组合物，其包含上述第二方面的nk细胞或包含nk细胞的细胞培养物。
8、本专利技术的优势至少在于如下各项：
9、(1)本专利技术的方法在诱导分化期间使用了悬浮培养，可在短期内(40天左右)使用1×105的ipscs获得大于1×107的nk细胞，适于规模化细胞制剂生产与临床应用。
10、(2)通过特定小分子化合物和细胞因子的联合使用，能够快速、高效、低成本地完成所述方法，并且操作简便、结果稳定，利于规模化nk生产。
11、(3)本专利技术的方法使用化学成分确定的培养基(chemically defined media)，具体而言不使用血清和饲养层细胞，也不使用dll4等基质胶，因此适于扩大生产，并且特别适合用于生产临床应用的nk细胞。
12、(4)本专利技术的方法获得的nk细胞具有高纯度和理想的功能性，最终培养体系中cd56+nk细胞比例可达95％以上，仅含少量的杂质细胞。
13、(5)本专利技术的方法通过在造血祖细胞分化为nk细胞的过程中使用特定抑制剂，抑制了其向肥大细胞的分化，提高了获得的nk前体细胞的比例。
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1.一种将人多能干细胞(hPSCs)分化为造血祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
2.一种将人多能干细胞(hPSCs)分化为NK细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
3.权利要求2所述的方法，进一步包括：
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基A的基础培养基为CTS-E8培养基。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基B的基础培养基为CTS-E6培养基。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基C的基础培养基为Stemline II培养基。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基A中的CHIR99021浓度为1至6μM，BMP4浓度为5ng/mL至200ng/mL，和/或VEGF浓度为5ng/mL至300ng/mL。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基B中的SCF浓度为5至200ng/mL，SB431542浓度为1至10μM，和/或VEGF浓度为5ng/mL
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基C中的SCF浓度为5至200ng/mL，FLT3L浓度为5至200ng/mL，和/或TPO浓度为5ng/mL至200ng/mL。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，所述步骤(2)、步骤(3a)、步骤(3b)、步骤(3c)、步骤(4)中的一步或多步为悬浮培养。
11.权利要求2-10中任一项所述的方法，所述步骤(4)使用的NK细胞分化培养基中的因子组合包含SCF、FLT3L、IL-7和IL-15。
12.权利要求11中所述的方法，其中SCF浓度为5ng/mL至200ng/mL，FLT3L浓度为5ng/mL至200ng/mL，IL-7浓度为5ng/mL至200ng/mL，和/或IL-15浓度为5ng/mL至200ng/mL。
13.权利要求2-12中任一项所述的方法，其中在所述步骤(4)的培养中使用C/EBPα抑制剂和/或RARα抑制剂。
14.权利要求13所述的方法，其中所述C/EBPα抑制剂选自岩藻甾醇、仙鹤草酚B(Agrimol B)或6-硫代肌苷，和/或所述RARα抑制剂选自AGN192870、AGN193109或LE135。
15.权利要求13或14所述的方法，其中所述C/EBPα抑制剂为6-硫代肌苷，和/或所述RARα抑制剂为AGN193109。
16.权利要求15所述的方法，其中所述6-硫代肌苷以10至30μM，优选约20μM的浓度使用；和/或所述AGN193109以5至20nM，优选约10nM的浓度使用。
17.权利要求3-16中任一项所述的方法，所述步骤(5)使用的NK细胞扩增培养基中的因子组合包含：IL-2、IL-15和IL-21。
18.权利要求17中所述的方法，其中IL-2浓度为20至300ng/mL，IL-15浓度为5至200ng/mL，和/或IL-21浓度为5至200ng/mL。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞经过基因修饰。
20.通过权利要求1-19中任一项所述的方法获得的造血祖细胞或包含造血祖细胞的细胞群体。
21.通过权利要求2-19中任一项所述的方法获得的NK细胞或包含NK细胞的细胞群体。
22.一种细胞制剂，其包含权利要求20所述的造血祖细胞或包含造血祖细胞的细胞群体，或权利要求21所述的NK细胞或包含NK细胞的细胞群体。
23.权利要求20所述的造血祖细胞或包含造血祖细胞的细胞群体，或权利要求21所述的NK细胞或包含NK细胞的细胞群体，在制备用于细胞治疗的药物中的用途。
24.权利要求20所述的造血祖细胞或包含造血祖细胞的细胞群体，或权利要求21所述的NK细胞或包含NK细胞的细胞群体用于非治疗目的中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种将人多能干细胞(hpscs)分化为造血祖细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
2.一种将人多能干细胞(hpscs)分化为nk细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
3.权利要求2所述的方法，进一步包括：
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基a的基础培养基为cts-e8培养基。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基b的基础培养基为cts-e6培养基。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基c的基础培养基为stemline ii培养基。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基a中的chir99021浓度为1至6μm，bmp4浓度为5ng/ml至200ng/ml，和/或vegf浓度为5ng/ml至300ng/ml。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基b中的scf浓度为5至200ng/ml，sb431542浓度为1至10μm，和/或vegf浓度为5ng/ml至300ng/ml。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述造血祖细胞分化培养基c中的scf浓度为5至200ng/ml，flt3l浓度为5至200ng/ml，和/或tpo浓度为5ng/ml至200ng/ml。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，所述步骤(2)、步骤(3a)、步骤(3b)、步骤(3c)、步骤(4)中的一步或多步为悬浮培养。
11.权利要求2-10中任一项所述的方法，所述步骤(4)使用的nk细胞分化培养基中的因子组合包含scf、flt3l、il-7和il-15。
12.权利要求11中所述的方法，其中scf浓度为5ng/ml至200ng/ml，flt3l浓度为5ng/ml至200ng/ml，il-7浓度为5ng/ml至200ng/ml，和/或il-15浓度为5ng/ml至...
【专利技术属性】
技术研发人员：范靖，王安欣，任芳，章薇垚，
申请(专利权)人：浙江霍德生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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