【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种表征目标多核苷酸的方法，特别涉及一种pht纳米孔突变体蛋白及其应用，属于基因工程和遗传工程领域。
技术介绍
1、纳米孔测序技术是近年被开发出来的新型核酸测序技术。依据孔道类型可分为固态孔和生物纳米孔，生物纳米孔即能够允许底物通过的孔道蛋白，以下纳米孔测序单指生物纳米孔测序技术。在电场力的作用下，带电核酸底物能够通过生物纳米孔。当核酸通过纳米孔时，能够阻碍纳米孔的电流，产生不同的电流信号，通过对电流信号的解析，可以获得核酸的碱基信息。和其它测序方法相比，它具有设备低廉，样品准备简便，测序速度快等优势，已经开始得到广泛应用。具体优势如下：在无需扩增的情况下，即可简便的建库；信号读取速度快，通常能达到200-300bp/s；读取长度长，通常可以达到数千个碱基；并且可以直接检测dna上存在的修饰；可以直接测rna，基于纳米孔测序的特点，rna不再需要逆转录为dna进行序列分析，由此便可以保存rna上的修饰信息。
2、孔道蛋白是影响纳米孔测序的关键技术之一，孔道蛋白的收缩区(读取头)特征对于获取原始电流信号具有较大影响。目前孔道蛋白种类单一，常用的大肠杆菌csgg突变体收缩区能够容纳4-5个碱基，因此单次记录的电流信号由4-5个碱基的阻碍作用产生，造成后续信号分析难度较大，造成准确率难以达到二代测序的水平。因此，需要发掘具有新型收缩区的孔道蛋白，一方面能够增加纳米孔的可选择种类，另一方面减少电流信号解析难度，进一步提高测序的准确率。
技术实现思路
1、本专利技术
2、本专利技术通过系统的氨基酸序列比对、选择，蛋白表达、纯化，结构解析等手段，并通过氨基酸突变手段，分别表达、纯化了收缩区氨基酸不同突变体蛋白，结合磷脂膜电流信号检测手段，确定了不同突变体蛋白的膜信号特征；选取噪音较小的突变体蛋白，确定了其核酸检测能力。本专利技术涉及技术包括，大肠杆菌膜蛋白表达载体的构建、突变体蛋白的载体构建；膜蛋白的表达、纯化；冷冻电镜样品制备、数据收集、结构解析、结构搭建、结构分析；纳米孔蛋白磷脂膜嵌入技术、电流信号记录、处理等。
3、第一方面，本专利技术提供一种pht纳米孔突变体蛋白，所述pht纳米孔突变体蛋白将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸突变为其他氨基酸(例如f87、f84、n83、a85、e235)，或者敲除seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸(例如敲除第80-86位氨基酸中的一个或多个)。
4、其他氨基酸包括天然氨基酸和/或非天然氨基酸。天然氨基酸为其他19种氨基酸。
5、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白选自：
6、1)将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的f87、f84、n83、a85氨基酸中的一个或多个突变为其他19种氨基酸；
7、2)将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的e235氨基酸突变为其他19种氨基酸；
8、3)敲除seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第80、81、82、83、84、85、86位氨基酸中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个等)。
9、其他19种氨基酸指的是除原位点氨基酸外的20种常见氨基酸中的其他19种氨基酸。20种常见氨基酸为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
10、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白收缩区氨基酸f87突变为其他19种氨基酸。
11、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白收缩区氨基酸f87突变为：f87m、f87p、f87l、f87g、f87i、f87q、f87e、f87c、f87r、f87h、f87k、f87t、f87a、f87s、f87y、f87n、f87v或f87d。
12、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白收缩区氨基酸f87突变为f87t、f87l、f87n。
13、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸n83突变为其他19种氨基酸。
14、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸n83突变为：n83d、n83s。在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸f84突变为其他19种氨基酸。在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸f84突变为：f84s、f84n、f84k、f84h、f84d、f84w、f84r、f84s、f84e、f84p、f84l、f84a、f84v、f84g、f84m；优选为f84s、f84n、f84k。
15、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸a85突变为其他19种氨基酸。
16、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸a85突变为：a85f、a85n、a85h、a85q、a85s、a85l、a85d、a85c、a85i、a85p、a85t、a85g、a85m、a85w、a85r；优选为a85i。
17、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸e235突变为其他19种氨基酸。
18、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的氨基酸e235突变为：e235n。
19、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是敲除seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的第85、86位氨基酸中的一个或多个(例如1个、2个)；例如敲除第85和第86位氨基酸。
20、在一些实施方案中，所述pht纳米孔突变体蛋白是敲除s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PHT纳米孔突变体蛋白，其特征在于，所述PHT纳米孔突变体蛋白将SEQ ID NO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸突变为其他氨基酸，或者敲除SEQ IDNO:1所示的野生型pht纳米孔蛋白中的一个或多个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的纳米孔蛋白，其特征在于，所述PHT纳米孔突变体蛋白选自：
3.一种编码权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的编码基因；
4.一种包含如权利要求3所述的编码基因的重组载体；或，一种包含如所述重组载体的重组菌；或，一种包含如权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的产品；优选地，所述产品是组合物、复合物、试剂盒。
5.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的重组载体，或者所述细胞的基因组中包含权利要求3所述的编码基因。
6.一种如权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.一种膜层，其特征在于，所述膜层中嵌入权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白；优选地，所述膜层是磷脂膜层；优选地
8.一种检测系统，其特征在于，包括权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白或者权利要求7所述的膜层。
9.一种装置，其特征在于，包括权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白、权利要求7所述的膜层或者权利要求8所述的检测系统。
10.权利要求1或2所述的PHT纳米孔突变体蛋白、权利要求7所述的膜层、权利要求8所述的检测系统或权利要求9所述的装置在样品测序和/或检测中的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种pht纳米孔突变体蛋白，其特征在于，所述pht纳米孔突变体蛋白将seq id no:1所示的野生型pht纳米孔蛋白的一个或多个氨基酸突变为其他氨基酸，或者敲除seq idno:1所示的野生型pht纳米孔蛋白中的一个或多个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的纳米孔蛋白，其特征在于，所述pht纳米孔突变体蛋白选自：
3.一种编码权利要求1或2所述的pht纳米孔突变体蛋白的编码基因；
4.一种包含如权利要求3所述的编码基因的重组载体；或，一种包含如所述重组载体的重组菌；或，一种包含如权利要求1或2所述的pht纳米孔突变体蛋白的产品；优选地，所述产品是组合物、复合物、试剂盒。
5.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的重组载体，或者所述细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：张满丰，张宁，
申请(专利权)人：北京普译生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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