【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及羰基还原酶突变体及其在制备(s)-玻色因中的应用。
技术介绍
1、玻色因，化学名为羟丙基四氢吡喃三醇，是一种具有抗衰老活性的木糖衍生物，具有(r)-玻色因与(s)-玻色因等两种构型，且两种构型均具有活性，其中，(s)-玻色因是对细胞刺激效果最佳的构型，研究表明，(s)-玻色因能够促进受损组织的再生，帮助维持真皮的弹性，预防皮肤老化且易于生物降解，在护肤品、彩妆、洗浴用品等行业有极高的应用价值。
2、随着当前世界各国对药品和化妆品使用标准的提高，通过新方法实现高收率是目前对工业生产(s)-玻色因的实际需求。
3、(s)-玻色因最初主要是采用化学的方法进行合成，如2014年philippe等用重金属催化剂ru/c对羰基进行还原；2020年王长斌等通过三乙酰氧基硼氢化钠还原羰基来制备(s)-玻色因，然而化学合成法存在除盐步骤繁琐、立体选择性差、成本高、不环保等问题。
4、近年来，由于生物酶法合成(s)-构型玻色因具有安全高效，成本低廉，立体选择性专一且对环境更加友好等优势，因此成为(s)-玻色因工业合成的主要研究方法。尽管生物酶法具有诸多优点，然而目前也仅有国内几篇专利报道通过生物酶法实现了此步的还原，也仍存在适用底物浓度不高（cn115747272a）、酶催化效率低（cn115896199a)、酶制剂的工业生产条件适应性不强（cn114507681a）等问题，生物酶法高效合成高浓度(s)-玻色因的方法尚有待开发。
5、因此，若是能开发出催化能力更强的
技术实现思路
1、为了实现以1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮为原料高效合成高纯度(s)-玻色因，本专利技术开发了能够高效催化1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮反应制备(s)-玻色因的羰基还原酶突变体，同时还提供了与该羰基还原酶对应的氨基酸序列、对应基因的核苷酸序列、重组表达质粒、基因工程菌株及其制备方法，以及该羰基还原酶在立体专一性合成(s)-玻色因中的应用。
2、本专利技术从实验室现有的酶库入手，得到了来自假丝酵母菌 candidaorthopsilosisco的羰基还原酶cocr13作为初始羰基还原酶，对该初始羰基还原酶编码基因进行定点突变，并对所获得的突变体进行筛选，确定了影响初始羰基还原酶酶学性质的关键残基，同时获得了具有高活性的羰基还原酶突变体。实验结果表明，将筛选获得的羰基还原酶突变体应用于以1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮为底物制备(s)-玻色因的催化反应中表现出良好的催化效果。
3、本专利技术所提供的羰基还原酶突变体，其蛋白质的氨基酸序列选择如下的序列之一：
4、（1）如seq id no:3所示的氨基酸序列：将seq id no:1所示氨基酸序列的第135位精氨酸替换为甘氨酸，第163位丝氨酸替换为甲硫氨酸，且第192位苏氨酸替换为丙氨酸；
5、（2）如seq id no:5所示的氨基酸序列：将seq id no:1所示氨基酸序列的第135位精氨酸替换为甘氨酸，第236位天冬氨酸替换为甲硫氨酸，且第211位丝氨酸替换为丙氨酸；
6、（3）如seq id no:7所示的氨基酸序列：将seq id no:1所示氨基酸序列的第230位苯丙氨酸替换为甘氨酸，第163位丝氨酸替换为甲硫氨酸，且第192位苏氨酸替换为丙氨酸；
7、（4）如seq id no:9所示的氨基酸序列：将seq id no:1所示氨基酸序列的第230位苯丙氨酸替换为甘氨酸，第236位天冬氨酸替换为甲硫氨酸，且第211位丝氨酸替换为丙氨酸；
8、（5）如seq id no:11所示的氨基酸序列：将seq id no:1所示氨基酸序列的第231位缬氨酸替换为甘氨酸，第163位丝氨酸替换为甲硫氨酸，且第192位苏氨酸替换为丙氨酸；
9、（6）如seq id no:13所示的氨基酸序列：将seq id no:1所示氨基酸序列的第231位缬氨酸替换为甘氨酸，第236位天冬氨酸替换为甲硫氨酸，且第211位丝氨酸替换为丙氨酸。
10、编码上述羰基还原酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列选自如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seqid no:14中所示的任一种。
11、此外，本专利技术还提供了上述的羰基还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：以来自假丝酵母菌 candidaorthopsilosis co的羰基还原酶cocr13作为初始羰基还原酶，对该初始羰基还原酶编码基因进行定点突变，并对所获得的突变体进行筛选，筛选完成后构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。
12、进一步的，本专利技术利用分子克隆技术获得了突变体的编码基因，并通过构建突变体基因的6×his融合表达载体并导入基因工程菌大肠杆菌超级感受态细胞（e.colioverexpress c43，de3）中诱导表达，获得突变体酶蛋白，以突变体为催化剂、以1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮为底物在适当的条件下进行酶催化反应。结果表明，本专利技术提供的突变体合成(s)-玻色因ee值能够达到99.9%，催化效率较野生型羰基还原酶提高了35.93倍，在(s)-玻色因的工业生产中都有巨大的应用潜力和价值。
13、本专利技术以上所提及的所有突变位点及任意组合突变编码羰基还原酶突变体的基因均为本专利技术所要重点保护的内容。此外，包含所述基因的表达盒﹑载体或者重组菌同样落入本专利技术所保护的技术范围中。
14、同理，包含了上述羰基还原酶突变体的催化剂，同样是本专利技术所保护的
技术实现思路
。
15、更进一步地，本专利技术还提供了上述羰基还原酶突变体或包含了上述羰基还原酶突变体的催化剂在制备(s)-玻色因中的应用，具体是以1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮为底物进行催化反应，合成(s)-玻色因。
16、优选的，所述的应用具体是：使用上述的羰基还原酶突变体或包含了上述羰基还原酶突变体的催化剂以1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮为底物，在25~40℃，ph=6.0~8.0、1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮浓度为1000 mm的条件下进行催化反应，合成(s)-玻色因。
17、本专利技术的有益效果在于：
18、（1）本专利技术通过对假丝酵母菌 candidaorthopsilosisco来源的羰基还原酶cocr13进行改造，并对相应的突变体进行筛选，确定了影响初始羰基还原酶酶学性质的关键残基，同时获得了高活性的羰基还原酶突变体，实现了以1-c-(β-d-吡喃木糖基)-丙酮为原料生产(s)-玻色因的高效催本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.羰基还原酶突变体，其特征在于，所述的羰基还原酶突变体，其蛋白质的氨基酸序列选择如下序列之一：
2.编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14中所示的任一种。
4.包含权利要求2所述基因的表达盒、载体或重组菌。
5.权利要求1所述的羰基还原酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以来自假丝酵母菌Candidaorthopsilosis Co的羰基还原酶CoCR13作为初始羰基还原酶，对该初始羰基还原酶编码基因进行定点突变，并对所获得的突变体进行筛选，筛选完成后构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。
6.权利要求1所述的羰基还原酶突变体在制备(S)-玻色因中的应用，其特征在于，以1-C-(β-D-吡喃木糖基)-丙酮为底物进行催化反应，合成(S)-玻色因。
7.如权利要求6所述的羰
8.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含权利要求1所述的羰基还原酶突变体。
9.权利要求8所述的催化剂在制备(S)-玻色因中的应用，其特征在于，以1-C-(β-D-吡喃木糖基)-丙酮为底物，在25~40℃、pH=6.0~8.0、1-C-(β-D-吡喃木糖基)-丙酮浓度为1000mM的条件下进行催化反应，合成(S)-玻色因。
...【技术特征摘要】
1.羰基还原酶突变体，其特征在于，所述的羰基还原酶突变体，其蛋白质的氨基酸序列选择如下序列之一：
2.编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列选自如seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14中所示的任一种。
4.包含权利要求2所述基因的表达盒、载体或重组菌。
5.权利要求1所述的羰基还原酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以来自假丝酵母菌candidaorthopsilosis co的羰基还原酶cocr13作为初始羰基还原酶，对该初始羰基还原酶编码基因进行定点突变，并对所获得的突变体进行筛选，筛选完成后构建表达载体，转化蛋白表...
【专利技术属性】
技术研发人员：马钦元，王辉，王宾，徐克，崔希礼，兰江，管西博，商晶，
申请(专利权)人：山东金城生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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