【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种rna-seq测序技术检测未知病原体的方法。
技术介绍
1、由于各种新发和再发的感染性疾病持续出现,目前全球感染性疾病现状严峻,病原体呈现多样化和复杂化,严重威胁公众健康。而目前实验室的常规病原学检测方法普遍存在时效性差、灵敏度低、覆盖度不全等显著缺点。近年来，随着高通量测序技术的发展，宏基因组测序技术能覆盖更广范围的病原体，为不明原因的疑难重症、新发、突发病原体的鉴定提供了新的技术方法，宏基因组测序可以获取临床相关的微生物信息为目的，对标本中所有的核酸序列进行高通量测序分析，产生极高的数据量，在未知病原体发现方面具有十分重要的意义，但随之带来用于未知的病原体检测的宏基因组测序需将标本中dna病原和rna病原分开构建2个文库再同时检测，操作步骤繁琐，并且产出数据量繁杂，数据分析难度较大，难以临床应用等问题。
2、rna-seq技术是新一代转录组测序技术，它是一种高度灵敏和准确的检测基因转录组表达的高通量测序技术方法。对细菌、病毒、真菌和原核生物等进行rna-seq测序能够对广泛的微生物转录本进行注释和定量，可以弥补宏基因组无法检测微生物的基因表达量、分析微生物的活性的不足。然而，将rna-seq测序技术应用于未知病原体检测的相关研究还未见报道。
技术实现思路
1、鉴于此，本专利技术的目的是提供了一种rna-seq测序技术检测未知病原体的方法。本专利技术能够快速、准确地检测未知病原体及其基因特征，为新发突发传染病的病原学诊断和防控提供高通量
2、本专利技术目的是通过以下方式实现：
3、本专利技术提供一种rna-seq测序技术检测未知病原体的方法，所述的方法通过首先直接对未知病原体标本的rna进行高通量测序，然后对测序数据进行微生物种类生物信息学分析，通过rna-seq测序结合生物信息学分析获得未知病原微生物的种类。
4、基于上述技术方案，进一步地，所述的方法包括以下步骤：
5、s1：标本rna提取；
6、s2：rna文库构建；
7、s3：rna-seq测序；
8、s4：测序数据分析；
9、s5：测序结果报告。
10、基于上述技术方案，进一步地，所述的标本rna提取通过rna提取试剂盒或者自动核酸提取仪进行。
11、基于上述技术方案，进一步地，rna文库构建包括以下步骤：
12、1)将标本rna进行rna酶切，纯化酶切后rna片段，rna质量评估；
13、2)接头连接，反转录成cdna、纯化cdna；
14、3)cdna扩增，扩增后纯化，文库质量评估。
15、基于上述技术方案，进一步地，步骤1)中使用rna酶iii将rna片段化；纯化酶切后rna片段通过纯化磁珠完成；rna质量评估包括使用qubit对rna进行定量和用毛细管电泳仪检测rna片段分布情况。
16、基于上述技术方案，进一步地，步骤2)中接头连接、反转录成cdna通过试剂盒完成；反转录过程的反转录酶包括superscriptiii酶；纯化cdna通过纯化磁珠完成。
17、基于上述技术方案，进一步地，步骤3)中cdna扩增的具体过程为：准备barcode文库pcr混合液，将纯化得到的5-7ul cdna转移一个新的pcr管中，然后加入40-50ul barcode文库pcr混合液，再加入1-2ul选择的ion xpress rna-seq barcode bc primer。
18、基于上述技术方案，进一步地，扩增程序为hold 94℃2min，94℃30s、50℃30s、68℃30s 2个循环；94℃30s、62℃30s、68℃30s 14-16个循环；68℃5min。
19、基于上述技术方案，进一步地，步骤3)中纯化扩增的cdna通过纯化磁珠完成；文库质量评估包括使用qubit对cdna进行定量和用毛细管电泳仪检测cdna片段分布情况。
20、基于上述技术方案，进一步地，将不同的样本稀释到同一浓度，混合等量的稀释文库成为混合文库，稀释到80-120pm后准备上机。
21、基于上述技术方案，进一步地，rna-seq测序通过ion chef建库仪和iongenestudio s5测序仪进行测序。
22、基于上述技术方案，进一步地，测序数据分析包括以下步骤：
23、1)使用ion genestudio s5测序仪上micront分析插件抽取样本中1000-100000条原始下机序列数据进行标准化和格式转换处理后与数据库进行比对，进行taxonomy分类分析，得到初步的微生物分类结果；
24、2)下载测序原始序列数据，利用kraken2(v2.1.2)和可提高物种注释结果的准确性bracken软件联合将测序得到的全部原始序列比对到病毒、真核、原核微生物高质量序列的最新数据库中的物种或分类单元，再利用metaphlan4(version 4.0.6)物种分类工具将测序得到的所有原始序列比对到细菌和古细菌参考基因组，得到准确的样品中微生物物种组成的信息，并提供更精细各类微生物物种的相对丰度值。根据以上微生物分类结果，结合《人间传染的病原微生物名录》种类，确定标本中的可疑病原微生物种类；
25、3)使用spades(v3.15.5)软件提取测序原始数据中的报告给出的病原微生物的序列数据进行拼接，组装后序列与参考基因组比对来验证报告给出的病原微生物种类准确性。
26、基于上述技术方案，进一步地，测序结果报告包括病原微生物及其相对丰度、基因组覆盖率以及病原微生物基因特征。
27、本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：
28、1.本专利技术利用rna-seq测序技术具有发现新的物种信息的技术特点，通过对标本中所有微生物rna测序可同时检测dna和rna病原微生物，相较宏基因组测序降低成本、减少了操作步骤和数据分析运算负担。而且通过比对研究发现，在相同测序深度rna-seq测序的工作流程在准确性方面优于宏基因组测序。本专利技术在未知病原体检测中应用rna-seq技术在准确度更好的基础上将充分发挥其发现新物种的优势。
29、2.本专利技术在生物信息学分析流程上设计先对部分测序数据进行快速初步分析，再使用两种测序分析工具对全部原始测序数据分别进行细菌和病毒等微生物种类精细化分析，相较与常用的生物信息分析利用同一分析工具全部数据一起比对分析，在提高分析效率同时提高比对准确度，且更易发现新的微生物物种信息，并对报告的病原微生物的序列信息进行提取组装拼接，进一步获得更多、更完整的基因组序列信息，在验证病原体的同时获得病原体进化、基因溯源、变异等分子流行病特征信息，无需再用其它生物检测技术方法再去通过实验获取病原基因信息，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RNA-seq测序技术检测未知病原体的方法，其特征在于，所述的方法通过首先直接对未知病原体标本的RNA进行高通量测序，然后对测序数据进行微生物种类生物信息学分析，通过RNA-seq测序结合生物信息学分析获得未知病原微生物的种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的标本RNA提取通过RNA提取试剂盒或者自动核酸提取仪进行。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，RNA文库构建包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中使用RNA酶III将RNA片段化；纯化酶切后RNA片段通过纯化磁珠完成；RNA质量评估包括使用Qubit对RNA进行定量和用毛细管电泳仪检测RNA片段分布情况。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中接头连接、反转录成cDNA通过试剂盒完成；反转录过程的反转录酶包括SuperScriptIII酶；纯化cDNA通过纯化磁珠完成。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，RNA-Seq测序通过Ion Chef建库仪和IonGeneStudio S5测序仪进行测序。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测序数据分析包括以下步骤：
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测序结果报告包括病原微生物及其相对丰度、基因组覆盖率以及病原微生物基因特征。
...【技术特征摘要】
1.一种rna-seq测序技术检测未知病原体的方法，其特征在于，所述的方法通过首先直接对未知病原体标本的rna进行高通量测序，然后对测序数据进行微生物种类生物信息学分析，通过rna-seq测序结合生物信息学分析获得未知病原微生物的种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的标本rna提取通过rna提取试剂盒或者自动核酸提取仪进行。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，rna文库构建包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中使用rna酶iii将rna片段化；纯化酶切后rna片段通过纯化磁珠完成；rna质量评估包括使用qubit对rna进行定量和用毛细管电泳仪检测rna片段分布情况。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中接头连接、反转录成cdna通过试剂盒完成；反转录过程的反转录酶包括superscript...
【专利技术属性】
技术研发人员：栾明春，薄志坚，王越，郎兴莹，王欢，滕雪，周林，
申请(专利权)人：大连市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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