【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
技术实现思路
1、本公开通过提供用于修饰和检测假尿苷和5-羟甲基胞嘧啶的方法、组合物和试剂盒解决了某些需求。本公开的方面涉及修饰和检测假尿苷或5-羟甲基胞嘧啶的方法，包括在约6.5至约8.0的ph下用亚硫酸氢盐处理。如本公开的实施方案中所述，用亚硫酸氢盐在约6.5至约8.0(例如，7.0)的ph下处理核酸分子足以修饰假尿苷或5-羟甲基胞嘧啶，而不会诱导未修饰胞嘧啶的如常规亚硫酸氢盐处理(例如，ph＜6.0)所见的脱氨基作用。方法还可以包括逆转录和/或测序，用于假尿苷和/或5-羟甲基胞嘧啶的检测和定量。
2、本公开的实施方案包括修饰假尿苷的方法、检测假尿苷的方法、定量假尿苷的方法、修饰5-羟甲基胞嘧啶的方法、检测5-羟甲基胞嘧啶的方法、定量5-羟甲基胞嘧啶的方法、处理核酸样品的方法、分离含有5-羟甲基胞嘧啶的核酸分子的方法、假尿苷映射的方法、5-羟甲基胞嘧啶映射的方法、亚硫酸氢盐处理的方法、rna处理的方法、dna处理的方法和试剂盒。
3、本公开的方法可包括以下步骤的1个、2个、3个、4个或多于4个：在约6.5至约8.0的ph下用亚硫酸氢盐孵育rna分子，在6.5至8.0的ph下用亚硫酸氢盐孵育rna分子，在约6.5至约8.0的ph下用亚硫酸氢盐孵育dna分子，在6.5至8.0的ph下用亚硫酸氢盐孵育dna分子，进行逆转录反应，进行扩增反应，检测rna分子中的5-亚甲基磺酸胞嘧啶(cms)，检测dna分子中的cms，将核酸分子与抗cms抗体接触，产生包含rna
4、本公开的试剂盒可以包括下列组分的1个、2个、3个、4个或多于4个：包含亚硫酸氢盐的溶液、逆转录酶、多核苷酸激酶、缓冲液、试剂和使用说明，所述使用说明包括用亚硫酸氢盐溶液孵育核酸分子的说明。在一些实施方案中，本专利技术的试剂盒包括亚硫酸氢盐溶液(即，包含亚硫酸氢盐的溶液)，其中该溶液具有约6.5至约8.0的ph。在一些实施方案中，试剂盒包括亚硫酸氢盐溶液，其中该溶液具有约7.0的ph。可以从本公开的实施方案中排除任意一个或多于一个前述组件。
5、在一些实施方案中，本文公开了修饰假尿苷的方法，包括在约6.5至约8.0的ph下将包含假尿苷的核糖核酸(rna)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含经修饰的假尿苷的经修饰的rna分子。在一些实施方案中，该方法还包括使用逆转录酶对经修饰的rna分子进行逆转录，以产生脱氧核糖核酸(dna)分子。在一些实施方案中，该方法还包括对dna分子进行测序。在一些实施方案中，该方法还包括基于dna分子序列中缺失的位置确定假尿苷在rna分子中的位置。在一些实施方案中，孵育rna分子进行约4小时。
6、本文还公开了修饰5-羟甲基胞嘧啶的方法，包括将包含5-羟甲基胞嘧啶的核糖核酸(rna)分子与亚硫酸氢盐在约6.5至约8.0的ph下孵育，以产生包含5-亚甲基磺酸胞嘧啶(cms)的经修饰的rna分子。在一些实施方案中，该方法还包括检测经修饰的rna分子中的cms。在一些实施方案中，检测cms包括将经修饰的rna分子与抗cms抗体接触。在一些实施方案中，该方法还包括使用逆转录酶对经修饰的rna分子进行逆转录，以产生脱氧核糖核酸(dna)分子。在一些实施方案中，逆转录酶是superscript iv。在一些实施方案中，该方法还包括对dna分子进行测序。在一些实施方案中，孵育rna分子进行约1小时。
7、在一些实施方案中，在约65℃至约75℃的温度下进行rna分子的孵育。在一些实施方案中，在约或至少65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃，或其中可推导出的任意范围或值的温度下进行rna分子的孵育。在一些实施方案中，在至少95℃的温度下进行rna分子的孵育。在一些实施方案中，在大约或正好95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的温度下进行rna分子的孵育。在一些实施方案中，孵育rna分子进行约1小时至6小时。在一些实施方案中，将rna分子孵育约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时，或其中可衍生的任意范围或值。在一些实施方案中，孵育rna分子进行约4小时。在一些实施方案中，孵育rna分子最多进行30分钟。在一些实施方案中，孵育rna分子进行约或恰好30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟，或其中可推导出的任意范围或值。在一些实施方案中，将rna分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括加入氢醌。在一些实施方案中，rna分子是mrna分子、trna分子、rrna分子、snrna分子、mirna分子或lncrna分子。在一些实施方案中，rna分子来自cfrna样品。在一些实施方案中，rna分子是多个rna分子中的rna分子，其中该方法还包括定量多个rna分子中假尿苷的数量。
8、在一些实施方案中，本文还公开了修饰5-羟甲基胞嘧啶的方法，包括在约6.5至约8.0的ph下，将包含5-羟甲基胞嘧啶的脱氧核糖核酸(dna)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含5-亚甲基磺酸胞嘧啶(cms)的核酸分子。在一些实施方案中，在约65℃至约75℃的温度下进行dna分子的孵育。在一些实施方案中，在约65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃或75℃，或其中可推导出的任意范围或值的温度下进行dna分子的孵育。在一些实施方案中，孵育dna分子在约70℃的温度下进行。在一些实施方案中，孵育dna分子在至少95℃的温度下进行。在一些实施方案中，孵育dna分子在约或恰好95℃、96℃、97℃、98℃或99℃的温度下进行。在一些实施方案中，将dna分子孵育1小时至4小时。在一些实施方案中，将dna分子孵育约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时，或其中可衍生的任意范围或值。在一些实施方案中，孵育dna分子最多进行30分钟。在一些实施方案中，孵育dna分子进行约或恰好30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟，或其中可推导出的任意范围或值。在一些实施方案中，将dna分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括加入氢醌。在一些实施方案中，dna分子是基因组dna。在一些实施方案中，dna分子来自cfdna样品。在一些实施方案中，该方法还包括检测经修饰的dna分子中的cms。在一些实施方案中，检测dna包括将经修饰的dna分子与抗cms抗体接触。在一些实施方案中，该方法还包括对经修饰的dna分子进行测序。
9、在一些实施方本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于修饰假尿苷的方法，其包括在约6.5至约8.0的pH下将包含假尿苷的核糖核酸(RNA)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含经修饰的假尿苷的经修饰的RNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在约65℃至约75℃的温度下孵育RNA分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在约70℃的温度下孵育RNA分子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中pH为约6.9至约7.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中pH为约7.0。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中孵育RNA分子2小时至6小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其中孵育RNA分子约4小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将RNA分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括添加氢醌。
9.根据权利要求1在8中任一项所述的方法，其中亚硫酸氢盐为至少10重量％的亚硫酸氢钠。
10.根据权利要求9所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少20重量％的亚硫酸氢钠。
11.根据权利要求9所述的方
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其还包括使用逆转录酶对经修饰的RNA分子进行逆转录以产生脱氧核糖核酸(DNA)分子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中逆转录酶是SuperScript IV(SSIV)。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其还包括对DNA分子进行测序。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中RNA分子是mRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、snRNA分子、miRNA分子或lncRNA分子。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中RNA分子是多个RNA分子的RNA分子，其中所述方法还包括量化多个RNA分子中假尿苷的数量。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中RNA分子来自无细胞RNA样品。
18.一种用于修饰5-羟甲基胞嘧啶的方法，其包括在约6.5至约8.0的pH下将包含5-羟甲基胞嘧啶的核糖核酸(RNA)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含5-亚甲基磺酸胞嘧啶(CMS)的经修饰的RNA分子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在约65℃至约75℃的温度下孵育RNA分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在约70℃的温度下孵育RNA分子。
21.根据权利要求18所述的方法，其中在至少约95℃的温度下孵育RNA分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在约98℃的温度下孵育RNA分子。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中pH为约6.9至约7.1。
24.根据权利要求23所述的方法，其中pH为约7.0。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中孵育RNA分子1小时至6小时。
26.根据权利要求25所述的方法，其中孵育RNA分子约1小时。
27.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中孵育RNA分子少于30分钟。
28.根据权利要求27所述的方法，其中孵育RNA分子少于15分钟。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中将RNA分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括添加氢醌。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的方法，其中亚硫酸氢盐为至少10重量％的亚硫酸氢钠。
31.根据权利要求30的方法，其中亚硫酸氢盐是至少20重量％的亚硫酸氢钠。
32.根据权利要求30所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少25重量％的亚硫酸氢钠。
33.根据权利要求18至32中任一项所述的方法，其中RNA分子是mRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、snRNA分子、miRNA分子或lncRNA分子。
34.根据权利要求18至33中任一项的所述方法，其还包括检测经修饰的RNA分子中的CMS。
35.根据权利要求34所述的方法，其中检测CMS包括将经修饰的RNA分子与抗CMS抗体接触。
36.根据权利要求18至35中任一项所述的方法，其还包括使用逆转录酶对经修饰的RNA分子进行逆转录以产生脱氧核糖核酸(DNA)分子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中逆转录酶是SuperScript IV。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其还包括对DNA分子进行测序。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于修饰假尿苷的方法，其包括在约6.5至约8.0的ph下将包含假尿苷的核糖核酸(rna)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含经修饰的假尿苷的经修饰的rna分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在约65℃至约75℃的温度下孵育rna分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中在约70℃的温度下孵育rna分子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中ph为约6.9至约7.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中ph为约7.0。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中孵育rna分子2小时至6小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其中孵育rna分子约4小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将rna分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括添加氢醌。
9.根据权利要求1在8中任一项所述的方法，其中亚硫酸氢盐为至少10重量％的亚硫酸氢钠。
10.根据权利要求9所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少20重量％的亚硫酸氢钠。
11.根据权利要求9所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少25重量％的亚硫酸氢钠。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其还包括使用逆转录酶对经修饰的rna分子进行逆转录以产生脱氧核糖核酸(dna)分子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中逆转录酶是superscript iv(ssiv)。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其还包括对dna分子进行测序。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中rna分子是mrna分子、trna分子、rrna分子、snrna分子、mirna分子或lncrna分子。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中rna分子是多个rna分子的rna分子，其中所述方法还包括量化多个rna分子中假尿苷的数量。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中rna分子来自无细胞rna样品。
18.一种用于修饰5-羟甲基胞嘧啶的方法，其包括在约6.5至约8.0的ph下将包含5-羟甲基胞嘧啶的核糖核酸(rna)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含5-亚甲基磺酸胞嘧啶(cms)的经修饰的rna分子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在约65℃至约75℃的温度下孵育rna分子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在约70℃的温度下孵育rna分子。
21.根据权利要求18所述的方法，其中在至少约95℃的温度下孵育rna分子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在约98℃的温度下孵育rna分子。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中ph为约6.9至约7.1。
24.根据权利要求23所述的方法，其中ph为约7.0。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中孵育rna分子1小时至6小时。
26.根据权利要求25所述的方法，其中孵育rna分子约1小时。
27.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中孵育rna分子少于30分钟。
28.根据权利要求27所述的方法，其中孵育rna分子少于15分钟。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中将rna分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括添加氢醌。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的方法，其中亚硫酸氢盐为至少10重量％的亚硫酸氢钠。
31.根据权利要求30的方法，其中亚硫酸氢盐是至少20重量％的亚硫酸氢钠。
32.根据权利要求30所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少25重量％的亚硫酸氢钠。
33.根据权利要求18至32中任一项所述的方法，其中rna分子是mrna分子、trna分子、rrna分子、snrna分子、mirna分子或lncrna分子。
34.根据权利要求18至33中任一项的所述方法，其还包括检测经修饰的rna分子中的cms。
35.根据权利要求34所述的方法，其中检测cms包括将经修饰的rna分子与抗cms抗体接触。
36.根据权利要求18至35中任一项所述的方法，其还包括使用逆转录酶对经修饰的rna分子进行逆转录以产生脱氧核糖核酸(dna)分子。
37.根据权利要求36所述的方法，其中逆转录酶是superscript iv。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其还包括对dna分子进行测序。
39.根据权利要求18至38中任一项所述的方法，其中rna分子来自无细胞rna样品。
40.一种用于修饰5-羟甲基胞嘧啶的方法，其包括在6.5至8.0的ph下将包含5-羟甲基胞嘧啶的脱氧核糖核酸(dna)分子与亚硫酸氢盐一起孵育，以产生包含5-亚甲基磺酸胞嘧啶(cms)的核酸分子。
41.根据权利要求40所述的方法，其中在约65℃至约75℃的温度下孵育dna分子。
42.根据权利要求41所述的方法，其中在约70℃的温度下孵育dna分子。
43.根据权利要求40所述的方法，其中在至少约95℃的温度下孵育dna分子。
44.根据权利要求43所述的方法，其中在约98℃的温度下孵育dna分子。
45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中ph为约6.9至约7.1。
46.根据权利要求45所述的方法，其中ph为约7.0。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中孵育dna分子1小时至4小时。
48.根据权利要求47所述的方法，其中孵育dna分子约4小时。
49.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中孵育dna分子少于30分钟。
50.根据权利要求49所述的方法，其中孵育dna分子少于15分钟。
51.根据权利要求40至49中任一项所述的方法，其中将dna分子与亚硫酸氢盐一起孵育不包括添加氢醌。
52.根据权利要求40在51中任一项所述的方法，其中亚硫酸氢盐为至少10重量％的亚硫酸氢钠。
53.根据权利要求52所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少20重量％的亚硫酸氢钠。
54.根据权利要求52所述的方法，其中亚硫酸氢盐是至少25重量％的亚硫酸氢钠。
55.根据权利要求40至51中任一项所述的方法，其中亚硫酸氢盐是亚硫酸氢铵。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐是至少20％的亚硫酸氢铵。
57.根据权利要求40至54中任一项所述的方法，其中dna分子是基因组dna。
58.根据权...
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