【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及固定化脂肪酶，尤其涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、生物柴油是指以动植物油脂及废弃油脂等为原料，通过酯交换工艺制成的可替代化石柴油的液体燃料，与石化柴油相比，生物柴油生物可降解而且无毒，其燃烧对环境产生的有害影响远小于传统石化柴油，随着环保要求的提高，生物柴油可作为一种新型环境友好能源替代石化柴油。
2、目前生物柴油主要是用化学方法生产，化学法存在工艺复杂、醇需量大、产物难于回收及对环境污染大等缺点。生物酶法合成生物柴油除具有条件温和、醇用量少及无污染物排放等优点，酶法合成对原料油物无选择性，可用多种油脂作为原料油通过酯化或转酯化反应生成，其燃烧指标均与石化柴油相当或更优。
3、酶法合成生物柴油主要是经脂肪酶催化进行的反应，但游离的脂肪酶在反应过程中在有机溶剂中分散性不佳，多次使用后容易结块，降低反应速率和利用效率。仅能使用一次的话对产物和酶的分离造成困难，增加了经济成本。因此，将其固定在易于分散和分离的载体上，不仅可以提高酶在反应过程中的扩散效果，并且有利于酶的回收利用和产品的连续化生产。
4、在酶的固定化制剂的研究中，固定化载体的选择是一个重要的因素。固定化载体的种类繁多，使用一些有机聚合物如大孔树脂和离子交换树脂等作载体时，通过调变载体官能团和固定化方法等方式，可以使固定化脂肪酶获得较好的酯化活力，但从生产过程的规模性考虑，价格低廉和性质稳定的载体具有更好的经济适用性。
5、然而脂肪酶经固定化操作，固定于一些廉价的载体上，如二氧化硅、白炭黑
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种固定化脂肪酶及其制备方法和应用。
2、为了实现上述的目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面是提供一种固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：
4、步骤一，硅藻土的预处理，备用；
5、步骤二，硅藻土的改性，将预处理后的硅藻土加入溶剂中分散，再加入硅烷偶联剂，搅拌反应1-2h，过滤，水洗滤饼，干燥，备用；
6、步骤三，将改性硅藻土与脂肪酶溶液混合后，通过搅拌或者振荡，在4-40℃下固定化0.5-1h，过滤，水洗滤饼，干燥，得固定化脂肪酶。
7、进一步地，所述预处理的具体方法为：酸处理-水洗-碱处理-水洗，或水洗-酸处理-碱处理-水洗，或水洗-碱处理-碱处理-水洗，优选预处理方法为酸处理-水洗-碱处理-水洗；每步预处理的时间为硅藻土预处理总时间均分成4段的时间，每段时间1-2h；每步预处理的温度为30-80℃，优选60℃；所述碱处理所用氢氧化钠溶液的质量分数为2％-7％，优选3％-5％；所述酸处理所用盐酸溶液的质量分数为2％-7％，优选3％-5％。
8、进一步地，所述硅烷偶联剂为硅烷偶联剂a与硅烷偶联剂b的混合试剂；所述硅烷偶联剂a为氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、氯甲基三甲氧基硅烷、氯甲基三乙氧基硅烷、(3-氯丙基)三甲氧基硅烷、(3-氯丙基)三乙氧基硅烷、(3-溴丙基)三甲氧基硅烷、(3-溴丙基)三乙氧基硅烷中的一种或几种；所述硅烷偶联剂b为十二烷基三甲氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、异丁基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、烯丙基三甲氧基硅烷、烯丙基三乙氧基硅烷、环己基三甲氧基硅烷、环己基三乙氧基硅烷、环戊基三甲氧基硅烷、环戊基三乙氧基硅烷中的一种或几种。
9、进一步地，所述硅烷偶联剂a与硅烷偶联剂b的质量比为(0.1-1):1，优选(0.2-5):1。
10、进一步地，在步骤二的硅藻土溶液中，所述硅烷偶联剂的添加量为质量比0.2％-0.5％；添加后，所述硅烷偶联剂的浓度在1g/l以下，优选100-200mg/l。
11、进一步地，所述改性硅藻土加入所述脂肪酶溶液时，固液比为1-10g/l，优选2-4g/l；每克所述改性硅藻土对应脂肪酶的加入量为0.2-0.5g。
12、进一步地，步骤二中，所用溶剂为乙醇、水、甲醇、丙酮、异丙醇、乙腈、苯、甲苯中的一种或几种，优选乙醇。
13、进一步地，所述脂肪酶溶液为脂肪酶水溶液，其ph为6.5-10.5。
14、进一步地，固定化温度为40℃。
15、本专利技术第二方面是提供一种固定化脂肪酶，采用上述的制备方法制备得到。
16、本专利技术第三方面是提供上述的固定化脂肪酶在制备生物柴油中的应用，包括如下步骤：将甲醇、原料油、固定化脂肪酶和水混合均匀，反应制得生物柴油。
17、进一步地，所述甲醇和原料油的摩尔比为(3-6)：1，所述固定化脂肪酶的质量为a，甲醇和原料油质量之和为b，a/b为1％-5％；反应温度为40-60℃，优选50℃；反应时间为6-24h，优选12h。
18、进一步地，所述原料油为生物油脂，具体可以是植物油脂、动物油脂、废弃油脂、微生物油脂的一种或多种。
19、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
20、本专利技术制备的固定化脂肪酶，酶活性高、性质稳定、环境耐受力强，并且固定化工艺能耗、物耗低，更好地用于制备生物柴油。本专利技术的制备方法简单易行，不需要对硅藻土进行高温烘培或者大剂量酸碱处理，适合工业化生产。
21、本专利技术的技术方案中，使用改性硅藻土作为脂肪酶固定化载体，经过预处理和复配杂化改性，孔道兼具极性链段与非极性链段的双亲性部分，大大增加了载体在油-水两相反应介质中的分散性，兼容各种油性介质。通过因改性而生成的长链疏水片段来“吸附”酶中弱极性的疏水部分，同时还能增加载体与底物原料油分子中的浸润性，增加酶与底物的接触面积，提高脂肪酶的附着性和催化效率。而改性的极性片段能够有效维持脂肪酶分子的三维结构，减轻有机介质对脂肪酶分子结构的破坏，提高脂肪酶分子的稳定性。故用于固定化脂肪酶具有环境耐受力强、催化效率高的优点，还可以提高脂肪酶的稳定性，实现脂肪酶多次循环重复利用。
22、与现有生物柴油制备技术相比，本专利技术的优点在于：对原料油的来源不苛刻，生物柴油的转化率可达88％以上，并且经过20次循环使用依然可以保持80％以上的转化率。说明这种通过固定化酶的方法，有效地增加了酶的稳定性和催化活性，扩大了原料的来源范围，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预处理的具体方法为：酸处理-水洗-碱处理-水洗，或水洗-酸处理-碱处理-水洗，或水洗-碱处理-碱处理-水洗；每步预处理的时间为硅藻土预处理总时间均分成4段的时间，每段时间1-2h；每步预处理的温度为30-80℃；所述碱处理所用氢氧化钠溶液的质量分数为2％-7％；所述酸处理所用盐酸溶液的质量分数为2％-7％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为硅烷偶联剂A与硅烷偶联剂B的混合试剂；所述硅烷偶联剂A为氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、氯甲基三甲氧基硅烷、氯甲基三乙氧基硅烷、(3-氯丙基)三甲氧基硅烷、(3-氯丙基)三乙氧基硅烷、(3-溴丙基)三甲氧基硅烷、(3-溴丙基)三乙氧基硅烷中的一种或几种；所述硅烷偶联剂B为十二烷基三甲氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂A与硅烷偶联剂B的质量比为(0.1-1):1。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤二的硅藻土溶液中，所述硅烷偶联剂的添加量为质量比0.2％-0.5％；添加后，所述硅烷偶联剂的浓度在1g/L以下。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述改性硅藻土加入所述脂肪酶溶液时，固液比为1-10g/L；每克所述改性硅藻土对应脂肪酶的加入量为0.2-0.5g。
7.一种固定化脂肪酶，采用如权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到。
8.如权利要求7所述的固定化脂肪酶在制备生物柴油中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将甲醇、原料油、固定化脂肪酶和水混合均匀，反应制得生物柴油。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甲醇和原料油的摩尔比为(3-6)：1，所述固定化脂肪酶的质量为a，甲醇和原料油质量之和为b，a/b为1％-5％；反应温度为40-60℃，反应时间为6-24h。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述原料油为生物油脂，具体可以是植物油脂、动物油脂、废弃油脂、微生物油脂的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预处理的具体方法为：酸处理-水洗-碱处理-水洗，或水洗-酸处理-碱处理-水洗，或水洗-碱处理-碱处理-水洗；每步预处理的时间为硅藻土预处理总时间均分成4段的时间，每段时间1-2h；每步预处理的温度为30-80℃；所述碱处理所用氢氧化钠溶液的质量分数为2％-7％；所述酸处理所用盐酸溶液的质量分数为2％-7％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为硅烷偶联剂a与硅烷偶联剂b的混合试剂；所述硅烷偶联剂a为氨丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、氯甲基三甲氧基硅烷、氯甲基三乙氧基硅烷、(3-氯丙基)三甲氧基硅烷、(3-氯丙基)三乙氧基硅烷、(3-溴丙基)三甲氧基硅烷、(3-溴丙基)三乙氧基硅烷中的一种或几种；所述硅烷偶联剂b为十二烷基三甲氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷、十六烷基三甲氧基硅烷、十六烷基三乙氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、十八烷基三乙氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、异丁基三甲氧基硅烷、异丁基三乙氧基硅烷、烯丙基三甲氧基硅烷、烯丙基三乙氧基硅烷、环己基三甲氧基硅烷、环己基三乙氧基硅烷、环戊基三...
【专利技术属性】
技术研发人员：周方舟，陈栋，洪霞，丁伟军，程华，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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