【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因制备方法及其应用，更具体一点说，涉及一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法及其应用，属于生物基因工程领域。
技术介绍
1、近年来，由于抗生素的大量使用，某些病原体对药物产生了耐药性，抗生素难以有效地控制疾病的发生，而筛选新的抗生素需要比较长的周期，也极为困难。由于抗生素自身的作用机理，其对真菌感染没有明显作用。而抗菌肽具有不错的抗菌能力，并对真菌、病毒、寄生虫甚至癌细胞都有一定的杀伤作用，并且没有其他较大的副作用，在疾病治疗和药物研究上是不错的研究方向。因此，抗菌肽有广阔的应用前景，有望成为治疗癌症、抵抗病毒和菌类方面的潜在治疗药物。目前抗菌肽种类主要包括以下种类：
2、1.α-螺旋型抗菌肽：
3、α-螺旋型抗菌肽以cecropins和magainins家族为代表。cecropins又称为天蚕素，大概有30左右，含有31～39个氨基酸残基，分子量为4kd左右，不含半胱氨酸残基，不形成分子内二硫键；magainins是由非洲爪蟾皮肤中分离出的一组广谱阳离子型抗菌肽，含有21～27个氨基酸残基，不存在半胱氨酸残基，分子可以形成两亲α-螺旋结构，c端呈疏水性，n端呈亲水性。
4、2.β-折叠型抗菌肽：
5、此类抗菌肽种类很多，大多具有反平行的β-折叠结构，分子量为4～6kd，依靠2～3个二硫键维持其结构的稳定，主要包括哺乳动物α-防御素、β防御素、植物防御素和昆虫防御素等。α-防御素是由29～36个氨基酸残基组成的小分子多肽，其中6个高度保守的半胱氨酸形成3对二硫键；β
6、3.富含某类氨基酸的抗菌肽：
7、此类抗菌肽一般含有15～34个氨基酸残基，脯氨酸、精氨酸或甘氨酸的存在使肽链结构更加灵活，它们一般位于带正电的双亲螺旋n端与疏水c端的连接部位，对抗菌活性起重要作用。
8、4.具有环状结构的抗菌肽：
9、此类抗菌肽在c末端有一个分子内二硫键，从而在c末端形成一个环链结构，而n末端则为线状结构。如青蛙皮肤细胞产生的brevinins和牛中性粒细胞分泌的bactenecin均属于此类。这类抗菌肽通常有较强的抗菌活性。
10、抗菌肽的理化性质：抗菌肽通常是由13～52个左右的氨基酸残基构成，大多数都具有较好的水溶性。大部分抗菌肽等电点大于7，表现出较强的阳离子特征，且具有良好的热稳定性。同时，抗菌肽抗酸碱能力较强，对离子强度也有较强的抵抗作用。此外，部分抗菌肽还具备抵抗某些蛋白酶水解的能力。抗菌肽的抑菌效果与所带的正电荷有一定的关系。一般来说，肽链中含有大量带正电荷的氨基酸，在一定范围内抑菌强度随着所带净正电荷的增加而增强。大多数抗菌肽的疏水性在50％左右，对于有些抗菌肽来说，随着疏水性的增强其抑菌作用会得到加强但会牺牲其特异性。
11、抗菌肽结构简单，无高级结构，一般无翻译后修饰。纯化天然来源的抗菌肽难度较大，且其产量低，通过化学方法来合成则较为昂贵，经济费用高。采取大肠杆菌表达系统表达抗菌肽，既利用了该系统的优点，又避开了其缺点，一次大肠杆菌重组表达是一种很有应用潜力的获得抗菌肽的方法。但由于抗菌肽自身的抑制宿主菌的作用，导致原核表达产量低或不表达。而且抗菌肽在生物中含量少，提取步骤十分的复杂，难以从天然产物中进行直接提取，而化学合成法成本不低，且污染严重。因此，基因工程成为抗菌肽的主要生产方法，目前国内外许多实验室也进行了相关研究，但在真核表达系统如酵母菌中表达的抗菌肽n端修饰不完全，且产量较低，难以满足医药层面的需求。虽然大肠杆菌具有很多优良特性，比如它容易培养、生长的周期很短，而且培养的成本低，但表达的抗菌肽单体对宿主菌有毒害作用，对表达产量有一定影响。因此抗菌肽的应用受到了极大的制约。
12、因此，抗菌肽的深入研究与应用对我国的许多行业的发展具有重要意义，尤其是医药食品等行业。结合我国国情，加强对抗菌肽的摸索和研究是必然趋势，对促进抗菌肽的规模化制备和应用有不可忽视的作用。
技术实现思路
1、为了解决上述现有技术问题，本专利技术提供具有能够降低生产成本，解决原核表达载体系统表达抗菌肽产量低的难题等技术特点的一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法及其应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法，该方法包括：抗菌肽cm4融合串联序列的设计与合成，首先，设计含导肽序列phoa的多倍体融合序列，其次，抗菌肽cm4单体之间引入甲酸切割位点，然后直接合成获得设计好的目的融合序列，最后，通过基因合成获得含目的融合基因的重组载体puc-19-8×cm4。
4、优选的，所述目的融合序列由限制性内切酶位、导肽、n×(甲酸位点+抗菌肽)、限制性内切酶位点组成。
5、优选的，所述限制性内切酶位为ecor i，导肽为phoa，n取值为1-10，优选5-8，n属于正整数。所述限制性内切酶位为hind iii位点。
6、优选的，所述目的融合序列为：
7、gaattcatgaaacaaagcactattgcactggcactcttatcgttactgtttacccctgtgacaaaagccgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaacatccgtgacggtatcgttaaggctggtccggctgttgctgttgttggccaggctgccactatcgacccgcgttggaagatctttaagaaaatcgaaaaggttggtcagaac本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于该方法包括：抗菌肽CM4融合串联序列的设计与合成，首先，设计含导肽序列phoA的多倍体融合序列，其次，抗菌肽CM4单体之间引入甲酸切割位点，然后直接合成获得设计好的目的融合序列，最后，通过基因合成获得含目的融合基因的重组载体pUC-19-8×CM4。
2.根据权利要求1所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述目的融合序列由限制性内切酶位、导肽、n×(甲酸位点+抗菌肽)、限制性内切酶位点组成。
3.根据权利要求2所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述限制性内切酶位为EcoR I，导肽为phoA，n取值为1-10，所述限制性内切酶位为Hind III位点。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述目的融合序列为：
5.根据权利要求1所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述目的融合序列的氨基酸序列为：
6.根据权利要求1所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：还包括
7.根据权利要求1所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：还包括抗菌肽CM4串联融合蛋白的表达和分离纯化，具体为：
8.根据权利要求1所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：还包括抗菌肽CM4串联产物的切割，具体为：
9.根据权利要求8所述的一种CM4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：通过管碟法测定CM4抗菌肽切割单体的抗菌活性。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的CM4抗菌肽在食品、药物、饲料添加剂上的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于该方法包括：抗菌肽cm4融合串联序列的设计与合成，首先，设计含导肽序列phoa的多倍体融合序列，其次，抗菌肽cm4单体之间引入甲酸切割位点，然后直接合成获得设计好的目的融合序列，最后，通过基因合成获得含目的融合基因的重组载体puc-19-8×cm4。
2.根据权利要求1所述的一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述目的融合序列由限制性内切酶位、导肽、n×(甲酸位点+抗菌肽)、限制性内切酶位点组成。
3.根据权利要求2所述的一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述限制性内切酶位为ecor i，导肽为phoa，n取值为1-10，所述限制性内切酶位为hind iii位点。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种cm4抗菌肽的基因工程制备方法，其特征在于：所述目的...
【专利技术属性】
技术研发人员：聂作明，沈熠菁，陈勇，吕正兵，陈剑清，
申请(专利权)人：浙江安各洛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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