本发明专利技术尤其提供了一种缀合至NLS序列的引导RNA(NLS‑gRNA)及其制备和使用方法。例如，在一些实施例中，所述gRNA的3'端经由包含化学部分和肽间隔子的接头缀合至核定位序列(NLS)的N末端。
1、crispr/cas编辑系统包括将引导rna分子(grna)与cas核酸内切酶和相关酶联合使用，以用于基因编辑以及相关系统(包括碱基编辑)的应用。简单来说，一个或多个grna分子与cas蛋白组装为复合物，并且将核糖核酸复合物(rnp)引导到特定的dna(例如，在cas9和cas12系统中)和/或rna(例如，在cas13系统中)序列。
2、用于治疗应用的常见形式的grna为大约100个核苷酸的单一非天然rna，该单一非天然rna与cas蛋白诸如cas9形成核糖核蛋白。使crispr/cas编辑系统适应新技术(例如，基因编辑)的能力要求引导rna(grna)在靶细胞内持续足够长的时间以实现期望的编辑。核酸酶对grna的降解是实现期望的编辑的重大挑战。另外，grna需要组装为核糖核酸(rnp并高效转运至细胞核。
1、本文提供了增强用于crispr-cas系统中的grna的效力的方法、组合物和试剂盒。在一些方面，本专利技术提供了产生用于crispr-cas系统中的具有增加的效力的缀合至nls序列的grna(nls-grna)的方法，例如，增加成功编辑事件的频率。本专利技术的nls-grna可以提供grna到细胞核的更好的运输，以进行保护免受胞质rna酶的影响并增加用于形成rnp的grna的较高局部浓度。与不具有nls序列的对等grna相比，本专利技术的nls-grna具有显著更高的效力，并且与高度修饰的grna相比也显露出更高的效力。
>2、在一个方面，本专利技术尤其提供了一种引导rna(grna)，其包含通过接头连接至grna的核定位信号(nls)，其中接头包含缀合至grna的3'端的半胱氨酸残基。3、在一些实施例中，接头包含n末端处的半胱氨酸残基。在一些实施例中，接头包含c末端处的半胱氨酸残基。在一些实施例中，接头包含接头中的内部位点处的半胱氨酸残基。
4、在一些实施例中，接头缀合至grna的3'端。在一些实施例中，接头缀合至grna的5'端。在一些实施例中，接头缀合至grna中的内部区域。在一些实施例中，接头缀合至grna中的第一发夹区域。在一些实施例中，接头缀合至grna中的第二发夹区域。在一些实施例中，接头缀合至grna中的隆突区域。在一些实施例中，grna包含一个或多个修饰。在一些实施例中，一个或多个修饰为2'ome修饰。在一些实施例中，一个或多个修饰包括2'-氟修饰。在一些实施例中，一个或多个修饰包括硫代磷酸酯键。
5、在一些实施例中，grna不包含骨架修饰。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2、3、4、5、6、7、8和9个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2、3、4、5、6、7和8个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2、3、4、5、6和7个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2、3、4、5和6个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2、3、4和5个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2、3和4个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1、2和3个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1和2个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的3'端1个核苷酸处。
6、在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2、3、4、5、6、7、8和9个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2、3、4、5、6、7和8个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2、3、4、5、6和7个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2、3、4、5和6个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2、3、4和5个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2、3和4个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1、2和3个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1和2个核苷酸处。在一些实施例中，一个或多个修饰出现在距grna的5'端1个核苷酸处
7、在一些实施例中，多于10％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于20％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于30％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于35％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于40％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于45％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于50％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于55％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于60％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于65％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于70％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于75％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于80％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于85％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于88％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于90％的grna是经修饰的。在一些实施例中，多于95％的grna是经修饰的。
8、在一些实施例中，少于10％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于20％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于30％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于35％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于40％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于45％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于50％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于55％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于60％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于65％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于70％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于75％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于80％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于85％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于88％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于90％的grna是经修饰的。在一些实施例中，少于95％的grna是经修饰的。
9、在一些实施例中，grna缀合至一个或多个nls序列。在一些实施例中，grna可以包含3'端处或附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个nls、5'端处或附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个nls，或这些的组合(例如3'端处的一个或多个nls和5'端处的一个或多个nls)。当存在多于一个nls时，每一个均可以独立于其他而被选择，使得单个nls可以以多于一个拷贝存在和/或与以一个或多个拷贝存在的一个或多个其他nls组合存在。
10、nls的非限制性示例包括衍生自以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引导RNA(gRNA)，其包含通过接头连接至所述gRNA的核定位信号(NLS)，其中所述接头包含缀合至所述gRNA的3'端或5'端的半胱氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述gRNA包含一个或多个修饰。
3.根据权利要求2所述的gRNA，其中一个或多个修饰为2'-OMe、2'-氟基或硫代磷酸酯键。
4.根据权利要求2或3所述的gRNA，其中所述gRNA包含所述3'端处和/或所述5'端处的一个或多个修饰。
5.根据权利要求4所述的gRNA，其中所述一个或多个修饰出现在距所述gRNA的所述3'端1、2、3、4和/或5个核苷酸处。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的gRNA，其中所述一个或多个修饰出现在距所述gRNA的所述5'端1、2、3、4和/或5个核苷酸处。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的gRNA，其中gRNA的超过40％、50％、60％、70％或80％的核苷酸是经修饰的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中所述NLS衍生自猿猴病毒40(SV40)。p>
9.根据权利要求8所述的gRNA，其中所述NLS包含KKKRKV(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中所述接头进一步包含肽间隔子。
11.根据权利要求10所述的gRNA，其中所述肽间隔子包含KRTADGSEFESP(SEQ ID NO:58)的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中所述接头进一步包含将所述gRNA缀合至所述肽间隔子或者缀合至所述NLS的化学部分。
13.根据权利要求12所述的gRNA，其中所述化学部分共价附接至所述肽间隔子或所述NLS氨基酸序列的N末端，和/或所述gRNA的所述3'端。
14.根据权利要求12或13所述的gRNA，其中所述化学部分共价附接至所述肽间隔子或所述NLS的半胱氨酸残基。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的gRNA，其中所述化学部分包含马来酰亚胺-硫醇加合物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中与不具有所述NLS的gRNA相比，包含所述NLS的所述gRNA提高碱基编辑效率。
17.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA为单引导RNA(sgRNA)、tracrRNA或crRNA。
18.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包含SaCas9骨架序列。
19.根据权利要求18所述的gRNA，其中当结合至SaCas9或其变体时，所述gRNA对核酸序列5'-NNGRRT-3'或5'-GAGAAT-3'具有原型间隔子相邻基序(PAM)特异性。
20.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA包含核酸序列：5'-CAGUAUGGACACUGUCCAAA-3'(SEQ ID NO:2)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的gRNA，其中gRNA包含以下核酸序列中的一个或由以下核酸序列中的一个组成：
22.一种组合物，其包含与脂质纳米颗粒(LNP)缔合或封装在脂质纳米颗粒中的根据前述权利要求中任一项所述的gRNA。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述LNP进一步包含编码碱基编辑器的mRNA；
24.一种包含根据权利要求1至22中任一项所述的gRNA的组合物，所述组合物进一步包含核酸酶或编码所述核酸酶的mRNA。
25.一种包含根据权利要求1至22中任一项所述的gRNA的组合物，所述组合物进一步包含多核苷酸可编程DNA结合结构域或编码所述多核苷酸可编程DNA结合结构域的mRNA。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中所述组合物以介于1:1与10:1之间的比率包含gRNA和编码所述核酸酶的mRNA。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物以1:1的比率包含gRNA和编码所述核酸酶的mRNA。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物以3:1的比率包含gRNA和编码所述核酸酶的mRNA。
29.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物以9:1的比率包含gRNA和编码所述核酸酶的mRNA。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶或所述多核苷酸可编程DNA结合结构域为Cas蛋白。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述Cas...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种引导rna(grna)，其包含通过接头连接至所述grna的核定位信号(nls)，其中所述接头包含缀合至所述grna的3'端或5'端的半胱氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的grna，其中所述grna包含一个或多个修饰。
3.根据权利要求2所述的grna，其中一个或多个修饰为2'-ome、2'-氟基或硫代磷酸酯键。
4.根据权利要求2或3所述的grna，其中所述grna包含所述3'端处和/或所述5'端处的一个或多个修饰。
5.根据权利要求4所述的grna，其中所述一个或多个修饰出现在距所述grna的所述3'端1、2、3、4和/或5个核苷酸处。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的grna，其中所述一个或多个修饰出现在距所述grna的所述5'端1、2、3、4和/或5个核苷酸处。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的grna，其中grna的超过40％、50％、60％、70％或80％的核苷酸是经修饰的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中所述nls衍生自猿猴病毒40(sv40)。
9.根据权利要求8所述的grna，其中所述nls包含kkkrkv(seq id no:57)的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中所述接头进一步包含肽间隔子。
11.根据权利要求10所述的grna，其中所述肽间隔子包含krtadgsefesp(seq id no:58)的氨基酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中所述接头进一步包含将所述grna缀合至所述肽间隔子或者缀合至所述nls的化学部分。
13.根据权利要求12所述的grna，其中所述化学部分共价附接至所述肽间隔子或所述nls氨基酸序列的n末端，和/或所述grna的所述3'端。
14.根据权利要求12或13所述的grna，其中所述化学部分共价附接至所述肽间隔子或所述nls的半胱氨酸残基。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的grna，其中所述化学部分包含马来酰亚胺-硫醇加合物。
16.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中与不具有所述nls的grna相比，包含所述nls的所述grna提高碱基编辑效率。
17.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中所述grna为单引导rna(sgrna)、tracrrna或crrna。
18.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中所述grna包含sacas9骨架序列。
19.根据权利要求18所述的grna，其中当结合至sacas9或其变体时，所述grna对核酸序列5'-nngrrt-3'或5'-gagaat-3'具有原型间隔子相邻基序(pam)特异性。
20.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中所述grna包含核酸序列：5'-caguauggacacuguccaaa-3'(seq id no:2)。
21.根据前述权利要求中任一项所述的grna，其中grna包含以下核酸序列中的一个或由以下核酸序列中的一个组成：
22.一种组合物，其包含与脂质纳米颗粒(lnp)缔合或封装在脂质纳米颗粒中的根据前述权利要求中任一项所述的grna。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述lnp进一步包含编码碱基编辑器的mrna；
24.一种包含根据权利要求1至22中任一项所述的grna的组合物，所述组合物进一步包含核酸酶或编码所述核酸酶的mrna。
25.一种包含根据权利要求1至22中任一项所述的grna的组合物，所述组合物进一步包含多核苷酸可编程dna结合结构域或编码所述多核苷酸可编程dna结合结构域的mrna。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的组合物，其中所述组合物以介于1:1与10:1之间的比率包含grna和编码所述核酸酶的mrna。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物以1:1的比率包含grna和编码所述核酸酶的mrna。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述组合物以3:1的比率包含grna和编码所述核酸酶的mrna。
29.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物以9:1的比率包含grna和编码所述核酸酶的mrna。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶或所述多核苷酸可编程dna结合结构域为cas蛋白。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述cas蛋白为cas9。
32.根据权利要求30所述的组合物，其中所述cas蛋白为cpf1、cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12i、cas12j、cas12k或cas13。
33.根据权利要求24至32中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶或所述多核苷酸可编程dna结合结构域为切口酶。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶或所述多核苷酸可编程dna结合结构域是经修饰的。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶或所述多核苷酸可编程dna结合结构域融合至异源多肽。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述异源多肽为脱氨酶结构域。
37.一种复合物，其包含
38.一种复合物，其包含
39.根据权利要求37或38所述的复合物，其中所述腺苷脱氨酶与seq id no:3具有至少约90％或约95％同一性。
40.根据权利要求37或38所述的复合物，其中所述腺苷脱氨酶包含seq id no:3或基本上由其组成。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的复合物，其中腺苷脱氨酶变体包含seq idno:3的以下改变组合：i76y+v82g+y147d+f149y+q154s+d167n，或另一腺苷脱氨酶中的对应改变。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的复合物，其中所述多核苷酸可编程dna结合结构域为cas9。
43.根据权利要求42所述的复合物，其中所述cas9包含核酸酶失活cas9(dcas9)、cas9切口酶(ncas9)或核酸酶活性cas9。
44.根据权利要求42或43所述的复合物，其中所述cas9为金黄色葡萄球菌cas9(sacas9)、嗜热链球菌1cas9(st1cas9)、酿脓链球菌cas9(spcas9)或其变体。
45.根据权利要求37至44中任一项所述的复合物，其中所述腺苷脱氨酶变体结构域位于所述多核苷酸可编程dna结合结构域的内部。
46.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至21中任一项所述的grna、根据权利要求22至36中任一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·卡弗蒂，迈克尔·帕克，伊冯娜·阿拉廷肖斯，程洛一，
申请(专利权)人：比姆医疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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