【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及用于鹈鹕性别鉴定的raa-lfd引物、试剂盒及方法。
技术介绍
1、鸟类性别鉴定是鸟类生物多样性保护和生态学研究的重要内容。改进快速准确的鸟类性别鉴定方法在鸟类进化生物学、育种和保护研究中具有重要意义。然而，世界上60％的鸟类是单态鸟类，即外部特征在两性之间是无区别的，在形态和行为上无法区分。因此，在监测鸟类种群的生态和保护过程中，准确、快速地识别鸟类的性别是非常困难的。
2、目前，鸟类的性别鉴定可以通过形态学、外科学、细胞学和分子方法进行。其中，鸟类分子性别鉴定因其准确性、非侵入性和便捷性被广泛应用。它通常基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction；pcr)扩增位于z和w染色体上的染色体解旋酶dna结合蛋白(chromo-helicase-dna binding protein；chd)性染色体特异性基因。随着技术的发展，已经有多种分子方法应用于性别测定，包括高分辨率熔融分析(high-resolution melting；hrm)、实时pcr(real time pcr)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification；lamp)。然而，上述方法仍存在诸多不足，要么需要昂贵的设备，要么需要更多的引物。
3、白鹈鹕(great white pelican；pelecanus onocrotalus)属于鹈形目鹈鹕科鹈鹕属大型水禽，主要分布在世界各地的温暖水域，并且以鱼类为食。在我国被列为国家ⅱ级重点保护野
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供一种用于鹈鹕性别鉴定的raa-lfd引物，通过少量该引物配合raa-lfd方法，能简便、快速、灵敏地鉴定鹈鹕的性别，并且整个鉴定过程只需要恒温扩增30min左右，无需依靠复杂的设备，在鹈鹕临床性别鉴定和繁殖管理中具有潜在的应用价值。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于鹈鹕性别鉴定的raa-lfd引物，包括鉴别引物和阳性对照引物；所述鉴别引物包括：
3、正向引物：agagtatttgaagtatcgtcagtttccctt(seq id no：11)；
4、反向引物：tttagcatacaataattgccagtcttttcc(seq id no：12)。
5、本专利技术人在研究过程中发现，在诸多分子性别鉴定方法中，基于重组酶的等温扩增技术，重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification；rpa)或重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification,raa)只需要2条引物在37℃-42℃下扩增20-30分钟，即能得到结果。同时，横向测流层析检测(lateral flow detection；lfd)适用于rpa/raa产物的可视化。因此，本专利技术人设计了上述2组引物，该引物能够与raa-lfd方法配合使用，建立得到的一种基于raa-lfd的鹈鹕性别鉴定方法，分别利用重组酶等温扩增技术(rpa/raa)扩增白鹈鹕w染色体上的解旋酶dna结合蛋白(chromo-helicase-dna bindingprotein；chd)基因片段和鸟类6号染色体上的超保守元件(ultraconserved element；uce)基因片段，并将扩增产物结合侧流层检测技术(lateral flow detection；lfd)检测，从而快速测定鹈鹕基于w染色体的chd基因。
6、在其中一个实施例中，所述鉴别引物包括：
7、正向引物：fam-agagtatttgaagtatcgtcagtttccctt；
8、反向引物：biotin-tttagcatacaataattgccagtcttttcc。
9、在其中一个实施例中，所述阳性对照引物包括阳性对照正向引物、阳性对照反向引物，所述阳性对照正向引物选自：seq id no：13、15、17、19；
10、所述阳性对照反向引物选自：seq id no：14、16、18、20。
11、在其中一个实施例中，所述阳性对照正向引物包括：tctttggtctttagttaagaaattcgctcg(seq id no：15)；所述阳性对照反向引物包括：taccctgcagaacagtcctcataactcatc(seq id no：16)。
12、在其中一个实施例中，所述阳性对照正向引物包括：fam-tctttggtctttagttaagaaattcgctcg；所述阳性对照反向引物包括：biotin-taccctgcagaacagtcctcataactcatc。
13、本专利技术还提供了所述raa-lfd引物在制备用于鉴别鹈鹕性别的试剂和/或试剂盒中的应用。
14、本专利技术还提供了一种用于鹈鹕性别鉴定的试剂盒，，包括所述引物。
15、在其中一个实施例中，所述试剂盒包括raa-lfd反应体系，所述raa-lfd反应体系包括raa反应体系、lfd反应体系和所述引物。
16、在其中一个实施例中，所述鉴别引物的工作浓度为0.3-0.5μm。
17、本专利技术还提供了一种鹈鹕性别鉴别的方法，包括以下步骤：提取待测样本的dna，采用所述试剂盒进行raa反应，得到扩增产物，采用横向测流层析法对所述扩增产物进行检测。
18、上述基于可视化的raa-lfd建立的鹈鹕性别鉴别的方法，对于鸟类养殖业快速确定鹈鹕的性别具有重要意义。
19、在其中一个实施例中，所述待测样本包括羽毛。
20、利用本鹈鹕性别鉴别的方法，可以实现对鹈鹕的无创检测。
21、在其中一个实施例中，所述raa反应的条件为：39±2℃反应20-30min；
22、所述横向测流层析法包括：将所述扩增产物与缓冲液混合，得到稀释扩增产物，将测流层析试纸浸入所述稀释扩增产物，静置1-5min。
23、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
24、本专利技术的一种用于鹈鹕性别鉴定的raa-lfd引物、试剂盒及方法，采用少量该引物配合raa-lfd方法简便、快速、灵敏地鉴定鹈鹕的性别，并且整个鉴定过程只需要恒温扩增30min左右，无需依靠复杂的设备，在鹈鹕临床性别鉴定和繁殖管理中具有潜在的应用价值。采用该raa-lfd试剂盒进行检测，对雌鹈鹕具有普遍特异性，对雄鹈鹕无交叉反应，在39℃条件下30min检测灵敏度为0.1ng；基于raa-lfd的uce基因均可扩增雄雌鹈鹕，检出下限为25pg。该试剂盒与以此为基础的鹈鹕性别鉴别的方法，有望配备现场可部署的仪器，为快速可靠地检测鹈鹕的性别识别提供了一个现场平台。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于鹈鹕性别鉴定的RAA-LFD引物，其特征在于，包括鉴别引物和阳性对照引物；所述鉴别引物包括：
2.根据权利要求1所述的RAA-LFD引物，其特征在于，所述阳性对照引物包括阳性对照正向引物、阳性对照反向引物，所述阳性对照正向引物选自：SEQ ID NO：13、15、17、19；
3.根据权利要求2所述的RAA-LFD引物，其特征在于，所述阳性对照正向引物包括：TCTTTGGTCTTTAGTTAAGAAATTCGCTCG(SEQ ID NO：15)；所述阳性对照反向引物包括：TACCCTGCAGAACAGTCCTCATAACTCATC(SEQ ID NO：16)。
4.权利要求1-3中任一项所述RAA-LFD引物在制备用于鉴别鹈鹕性别的试剂和/或试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴别鹈鹕性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RAA-LFD反应体系，所述RAA-LFD反应体系包括RAA反应体系、LFD反应体系和权利要求1-3中任一项所述
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述鉴别引物的工作浓度为0.3-0.5μM。
8.一种鹈鹕性别鉴别的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，采用权利要求5-7中任一项所述的试剂盒进行RAA反应，得到扩增产物，采用横向测流层析法对所述扩增产物进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括羽毛。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RAA反应的条件为：39±2℃反应20-30min；
...【技术特征摘要】
1.一种用于鹈鹕性别鉴定的raa-lfd引物，其特征在于，包括鉴别引物和阳性对照引物；所述鉴别引物包括：
2.根据权利要求1所述的raa-lfd引物，其特征在于，所述阳性对照引物包括阳性对照正向引物、阳性对照反向引物，所述阳性对照正向引物选自：seq id no：13、15、17、19；
3.根据权利要求2所述的raa-lfd引物，其特征在于，所述阳性对照正向引物包括：tctttggtctttagttaagaaattcgctcg(seq id no：15)；所述阳性对照反向引物包括：taccctgcagaacagtcctcataactcatc(seq id no：16)。
4.权利要求1-3中任一项所述raa-lfd引物在制备用于鉴别鹈鹕性别的试剂和/或试剂盒中的应用。
5.一种用于鉴别鹈鹕...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾繁文，陈谭子芃，萨家祺，王国蒨，陈绚姣，吴其锐，
申请(专利权)人：广州动物园，
类型：发明
国别省市：
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