【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种以玉米秸秆水解液为底物发酵生产乙醇酸的方法，属于生物工程。
技术介绍
1、乙醇酸广泛应用于化学清洗、医药美妆和聚合物的生产。据统计，2022年中国乙醇酸市场消费量约2.3万吨/年。目前，国内乙醇酸的生产工艺相对落后，主要以氯乙酸法、甲醛氢羟基化法、腈化法和草酸酯加氢水解法为主，但是这些方法存在着反应条件苛刻、原料毒性强，环境污染大等诸多问题。微生物从可再生碳源中合成乙醇酸以反应条件温和、底物可再生和工艺过程绿色环保等优势受到了研究者的广泛关注。本专利技术使用可再生生物质原料，玉米秸秆水解液发酵生产乙醇酸。玉米秸秆水解液中含有大量的葡萄糖和木糖，菌株能够共同利用葡萄糖和木糖发酵生产乙醇酸是高产乙醇酸的前提，本专利技术提供了一种同时利用玉米秸秆水解液中葡萄糖和木糖高效生产乙醇酸的方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种同时利用玉米秸秆水解液中葡萄糖和木糖高效生产乙醇酸的方法。
2、在本专利技术的一种实施方式中，通过敲除ptsg(磷酸转移酶系统膜整合蛋白ⅱcbglc)解除了碳分解代谢物阻遏效应。
3、在本专利技术的一种实施方式中，通过引入来源于zymomonas mobilis的glf(葡萄糖转运蛋白)和glk(葡萄糖激酶)提高了菌株葡萄糖消耗速率，提高了乙醇酸的产率。
4、在本专利技术的一种实施方式中，通过过表达转录因子xylr及其相关突变体xylr(r121c)提高了菌株木糖消耗速率。
5、在本专利技术的一种实施
6、本专利技术提供了生产乙醇酸的方法。将大肠杆菌工程菌置于30-40℃下培养10-24h，按照1-3％的接种量转入装有50ml m9改良培养基的250ml三角瓶中，置于30-40℃，转速200-250r/min，摇瓶发酵生产乙醇酸。
7、在本专利技术的一种实施方式中，所述的m9改良培养基按g/l计，含有：na2hpo4 6～10，kh2po4 2～6，nh4cl 0.5～3，nacl 0.5～12，mgso4 0.15～1cacl2 0.1～1，胰蛋白胨7～20，酵母粉2～10，葡萄糖6～8。
8、优选的，m9改良培养基(g/l)：na2hpo4 6～8，kh2po4 2～4，nh4cl 1～2，nacl 0.5～2，mgso4 0.15～1(单独灭菌)，cacl2 0.1～1(单独灭菌)，胰蛋白胨8～10，酵母粉4～6，葡萄糖6～8(单独灭菌)。
9、本专利技术还提供所述的大肠杆菌工程菌或所述的方法在利用玉米秸秆水解液发酵制备乙醇酸或含有乙醇酸的产品方面的应用。
10、本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌是mgly6为底盘细胞，所述mgly6为敲除了ldha,glcb,aceb,alda,glcdef的大肠杆菌e.coli mg1655，进行下述(a)～(e)任一改造：
11、(a)敲除了底盘细胞基因组上glcc基因和stha基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因和zmedda基因；
12、(b)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因、stha基因和ptsg基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因和zmedda基因；
13、(c)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因、stha基因、ptsg基因和adhe基因，并在adhe基因位点上过表达了zmglfglk基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因和zmedda基因；
14、(d)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因、stha基因、ptsg基因和adhe基因，并在adhe基因位点上过表达了zmglfglk基因，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因、zmedda基因和xylr基因；
15、(e)敲除了底盘细胞基因组上的glcc基因、stha基因、ptsg基因和adhe基因，并在adhe基因位点上过表达了zmglfglk酶，同时过表达了glta基因、glcc基因、ycdw基因、acea基因、pntab基因、zmedda基因和xylr酶突变体基因；
16、所述glcc基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述stha基因的核苷酸序列如seq id no.4所示的，所述ptsg基因的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述adhe基因的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述zmglfglk基因的核苷酸序列如seq id no.9所示，glta基因的核苷酸序列如seq id no.17所示，ycdw基因的核苷酸序列如seq id no.18所示，acea基因的核苷酸序列如seq id no.19所示，pntab基因的核苷酸序列如seq id no.11所示，zmedda基因的核苷酸序列如seq id no.12～13所示，xylr基因的核苷酸序列如seq idno.14所示，xylr酶突变体基因的核苷酸序列如seq id no.15所示。
17、在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是采用pcdf-duet-1、ptrc99a、pacyc-duet-1为表达载体。
18、在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于e.coli mg1655。
19、在本专利技术的一种实施方式中，所述glta酶和glcc酶分别由核苷酸序列如seq idno.10所示的pglcd-b1启动子和核苷酸序列如seq id no.16所示pffs启动子控制表达。
20、在本专利技术的一种实施方式中，所述ycdw酶、acea酶、pntab酶核苷酸序列如seq idno.10所示的pglcd-b1启动子控制表达。
21、在本专利技术的一种实施方式中，所述xylr酶和xylr酶突变体是由核苷酸序列如seqid no.16所示pffs启动子控制表达。
22、本专利技术提供了一种发酵生产乙醇酸的方法，所述方法为，将上述基因工程菌添加至含有葡萄糖的反应体系中进行反应，发酵制备得到乙醇酸。
23、在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为30～40℃，发酵时间20～72h，所述发酵的转速为200-800r/min。
24、在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系按g/l计，含有na2hpo4 6～8，kh2po4 2～4，nh4cl 1～2，nacl 0.5～2，mgso4 0.15～1，cacl2 0.1～1，胰蛋白胨8～10，酵母粉4～6，葡萄糖6～8。
25、本专利技术还提供了一种发酵生产乙醇酸的方法，所述方法为，将上述基因工程菌添加至含有玉米秸秆水解液的反应体系中进行反应，发酵制备得到乙醇酸；所述玉米秸秆水解液的制备方法为：将玉米秸秆碾磨成40-60目大小的颗粒，干燥至恒重，然后在25本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以Mgly6为底盘细胞，进行下述(a)～(e)任一改造：
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是采用pCDF-Duet-1、pTrc99A、pACYC-Duet-1为表达载体。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述gltA基因和glcC基因分别由核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的PglcD-B1启动子和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示Pffs启动子控制表达。
4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述ycdW基因、aceA基因、pntAB基因是由核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的PglcD-B1启动子控制表达。
5.根据权利要求1～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述xylR基因是由核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示Pffs启动子控制表达。
6.根据权利要求1～5任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述xylR酶突变体基因是由核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示Pffs启动子
7.一种发酵生产乙醇酸的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～6任一所述的基因工程菌添加至含有葡萄糖的反应体系中进行反应，发酵制备得到乙醇酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30～40℃，发酵时间20～72h。
9.一种发酵生产乙醇酸的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～6任一所述的基因工程菌添加至含有玉米秸秆水解液的反应体系中进行反应，发酵制备得到乙醇酸；所述玉米秸秆水解液的制备方法为：将玉米秸秆碾磨成40-60目的颗粒，干燥至恒重，然后在25℃下用7wt％的NaOH和8wt％的氯化胆碱-聚乙二醇-10000混合物处理10min；过滤得到残渣，洗涤三次，干燥后备用；随后，将残渣溶解在醋酸钠-醋酸缓冲液中，用纤维素酶和木聚糖酶在50℃下对玉米秸秆进行酶糖化72h，离心，取上清灭菌后得到玉米秸秆水解液。
10.权利要求1～6任一所述的基因工程菌或权利要求7～9任一所述的方法在制备乙醇酸或含有乙醇酸的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以mgly6为底盘细胞，进行下述(a)～(e)任一改造：
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是采用pcdf-duet-1、ptrc99a、pacyc-duet-1为表达载体。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述glta基因和glcc基因分别由核苷酸序列如seq id no.10所示的pglcd-b1启动子和核苷酸序列如seq id no.16所示pffs启动子控制表达。
4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述ycdw基因、acea基因、pntab基因是由核苷酸序列如seq id no.10所示的pglcd-b1启动子控制表达。
5.根据权利要求1～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述xylr基因是由核苷酸序列如seq id no.16所示pffs启动子控制表达。
6.根据权利要求1～5任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述xylr酶突变体基因是由核苷酸序列如seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，周胜虎，杨海宁，李国辉，毛银，赵运英，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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