【技术实现步骤摘要】
本技术属于太子参芜菁花叶病毒检测领域，尤其涉及太子参芜菁花叶病毒的toeholdswitch传感器的设计和检测。
技术介绍
1、芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus,tumv)作为危害太子参生产的主要病毒，是马铃薯y病毒属(genuspotyvirus)中传播范围最广、危害最大的植物病毒。病毒的大量增殖不仅严重影响太子参的生长发育，还会影响其次生代谢产物的合成，减少有效药用成分，降低药材品质。
2、目前，植物病毒检测方法主要分为分子生物学和血清学检测。分子生物学检测灵敏度高，但待测样品的rna提取操作繁琐，后续的待测分子的扩增及检测依赖专业的检测人员和昂贵的仪器设备。血清学检测方便快捷，但检测的特异性依赖于检测抗体的质量。
3、近年来，太子参种植业饱受病毒病的影响，落后的病害监测技术制约太子参种植的高品质生产。因此建立操作方便，检测迅速的太子参病毒检测技术十分必要。
4、2014年，green等(greenaa,silverpa,collinsjj,yinp,toeholdswitches:de-novo-designed regulators ofgeneexpression[j].cell2014,159,925-939.)开发出一类新型rna调控元件——toehold switch，该元件5’端包含部分与待测rna互补配对的序列，随后是包含的强rbs序列和aug序列的rna茎环结构，下游包含报告基因。当无细胞检测系统中存在待测rna时，toeholdswitch传感器的5’端
技术实现思路
1、本专利技术提供一种基于toeholdswitch技术的太子参芜菁花叶病毒检测传感器及其组装方法，以提供一种操作简单、检测灵敏、反应快速的太子参芜菁花叶病毒检测方法。所述检测传感器的toehold switch元件序列如seq id no.1所示。
2、seq id no.1：
3、gggcgaccttgaccgatttcttcccgatgtactcaatgtggactttagaacagaggagata aagatgacattgagtaccaacctggcggcagcgcaaaag。
4、所述triggerrna序列为太子参芜菁花叶病毒的待测序列，长度为36nt，序列如seqid no.2所示。seq id no.2：acattgagtacatcgggaagaaatcggtcaaggtcg。
5、为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：
6、1、芜菁花叶病毒的toehold switch检测质粒的设计及构建，该检测质粒5’端包含36nt与芜菁花叶病毒保守序列互补的序列，茎环结构下游包含lacz报告基因。
7、2、nasba等温扩增系统：10×buffer 1(10％v/v)，5×buffer 2(20％v/v)，正向/反向引物(25μm)，dmso(7.5％v/v)，rna模板(5％v/v)，无核酸酶水补至20μl；其中10*buffer 1含400mm tris-hcl(ph 8.5)，700mm kcl，120mm mgcl2，50mmdtt，3.75m山梨醇，10mm dntps，40mmntps；buffer 2含5u/μl rnase抑制剂，0.5mg/mlbsa，5u/μl逆转录酶，12.5u/μlt7 rna聚合酶和0.5u/μl rnaseh。
8、3、toehold switch无细胞系统采用商用试剂盒(neb purexpress)，主要成分如下：buffera(40％v/v)，buffer b(30％v/v)；具体检测中需添加特异的toehold switch检测质粒(5nm)，nasba等温扩增体系反应液，酶解底物cprg(0.6mg/ml)，rna酶抑制剂(0.5％v/v)，无核酸酶水补至5.94μl。上述检测引物对或检测试剂盒用于检测太子参中的芜菁花叶病毒。
9、按以下步骤进行：
10、a.提取总rna：将适量的待检太子参样品通过液氮处理研磨成粉末，再提取样品的总rna；
11、b.nasba反应：1μl 10×buffer 1，2.5μl正向/反向引物(10μm)，添加1μl步骤a中提取的总rna，无核酸酶水补至18μl，以无核酸酶水代替rna模板作为阴性对照，充分混匀反应体系，将nasba反应体系置于65℃金属浴或水浴锅等温控装置中孵育5min，再置于41℃中孵育5min，随后添加酶体系2μl 5×buffer2，置于41℃中孵育150min。
12、c.无细胞检测体系：在检测体系中加入buffera(40％v/v)，buffer b(30％v/v)，toehold switch检测质粒(5nm)，b步骤中产物1μl，酶解底物cprg(0.6mg/ml)，rna酶抑制剂(0.5％v/v)，无核酸酶水补至5.94μl；以无核酸酶水代替rna模板作为阴性对照，体外合成的rna为阳性对照，充分混匀；置于37℃金属浴或水浴锅等温控装置中孵育60min；
13、d.检测结果判定：通过肉眼观察反应体系判断检测结果，体系从黄色变为紫色的为阳性，体系颜色几乎不变的为阴性。
14、针对现有太子参芜菁花叶病毒不能快速、准确在田间检测的问题，专利技术人以芜菁花叶病毒的p3蛋白核酸序列为靶序列设计了芜菁花叶病毒的toehold switch检测传感器，nasba等温扩增引物对，据此还研制了相应试剂盒并建立了相应检测方法。本专利技术可用于太子参的芜菁花叶病毒检测，研究表明，本专利技术方法最低可以检测到10fm，适合芜菁花叶病毒的田间检测。
15、与现有技术相比，本专利技术具有以下突出优点：
16、(1)toehold switch检测载体构建简单快速，构建toehold switch载体骨架，可随机更换toehold switch序列，可实现系列载体快速构建。
17、(2)设备简单：检测所需试剂均容易购买，并且成本低廉。此外，检测所需设备简单，只需水浴锅或金属浴等恒温设备即可，并且操作简单。
18、(3)操作简单：整个检测过程只需要粗提太子参rna，滴加rna至预先配制好的nasba体系中，等温孵育后再滴加至含toehold switch传感器的无细胞检测系统中。并且样品越多优越性越明显，利于田间和太子参种植公司的大规模推广应用，可对田间太子参芜菁花叶病毒带毒情况进行评估和统计，解决了大量样品检测耗时耗力，成本高昂的缺点。
19、(4)灵敏度高：检测的灵敏度可达到10fm。
20、(5)本专利技术提供的各种试剂的浓度和参数配比均是经精细调试优化所得。实现了样品需本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种太子参芜菁花叶病毒toehold switch检测传感器，其特征在于，所述检测传感器的Toehold switch元件序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种与权利要求1所述Toehold switch元件序列相配对的trigger RNA序列，其特征在于，所述trigger RNA序列为太子参芜菁花叶病毒的待测序列，长度为36nt，序列如SEQID NO.2所示。
3.一种用于扩增权利要求2所述trigger RNA序列的引物，其特征在于，序列如下：
4.一种利用权利要求1所述太子参芜菁花叶病毒toehold switch检测传感器检测病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述正向/反向引物序列如下：
7.如权利要求1所述的检测传感器在太子参芜菁花叶病毒检测中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种太子参芜菁花叶病毒toehold switch检测传感器，其特征在于，所述检测传感器的toehold switch元件序列如seq id no.1所示。
2.一种与权利要求1所述toehold switch元件序列相配对的trigger rna序列，其特征在于，所述trigger rna序列为太子参芜菁花叶病毒的待测序列，长度为36nt，序列如seqid no.2所示。
3.一种用于扩增权利要求2所述t...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。