【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及体外获得人多潜能干细胞来源的肾脏类器官领域。
技术介绍
1、慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)的患病率高达10％，给个人及社会带来了巨大的负担，目前除了透析和肾移植，仍没有有效的治疗方法。然而透析只能延缓疾病进展，唯一能实现治愈的肾移植又面临器官供体严重不足的现状，迫切需要找到新的有效治疗方案。研究ckd的发病机制有助于找到新的潜在治疗靶点，首要条件是建立有效的疾病模型。肾脏由多种细胞类型组成，具有复杂的生理结构，传统的体外细胞模型往往是单一的永生化细胞系，无论是基因表达谱、生理功能，还是在生理结构上都无法与体内肾脏相比；而动物模型与人存在种间差异，亦无法真实模拟人体，因此亟需一种能够更为真实模拟人体内肾脏器官的体外模型。
2、肾脏类器官是利用具有多潜能的人多潜能干细胞模拟体内肾脏器官发育，在体外分化进而获得。其不仅具有人类遗传背景，能够规避动物模型带来的种间差异，更产生出与体内对应器官相似的复杂三维结构及功能，具有单一类型的细胞系或原代细胞所不具备的优势。因此是模拟肾损伤疾病表型、筛选治疗药物及预测人体对潜在药物反应的理想体外模型。目前肾脏类器官领域的瓶颈问题包括：整体成熟度欠缺、血管化水平以及批次间稳定性不足，本领域已报道工作尝试从不同角度解决以上问题：
3、(1)有研究报道通过将肾脏类器官移植到健康活体宿主体内，能够提升肾脏类器官的成熟程度与血管化水平。例如将肾脏类器官移植到免疫缺陷小鼠的肾被膜下，移植物表现出足细胞成熟以及与宿主的血管网络
4、(2)有研究报道利用微液流技术显著提高体外培养的肾脏类器官的成熟程度与血管化水平。微液流技术(microfluidics)是一种微流体操控技术。由于传统细胞培养方法的操作环境与体内环境相差甚远，难以客观真实地反映生理状态下细胞的生物学特征。微液流能一定程度模拟体内微环境，例如提供在静止培养条件下缺少的流体剪切力等对肾脏类器官分化有重要作用的因素。一项研究证明在微流体装置上的流动条件下培养肾类器官会诱导类器官内可灌注的血管网络形成，支持了液体流动在诱导血管化中的作用，并且血管化水平与流体速度呈正相关。在该系统中培养的肾单位细胞，包括足细胞和肾小管上皮细胞，比在常规静态条件下培养的肾单位细胞表达更高水平的谱系标志物，这可能是由于它们与水平提升的血管内皮细胞间产生了通讯与互作从而进一步成熟了。该研究提示微液流对于肾脏类器官体外成熟的具有显著作用。该技术方法的弊端在于对微液流装置的依赖使得其技术门槛、成本高，难以重复与推广。
5、(3)有研究使用基于“挤出三维细胞生物打印”的技术来制造具有高通量及高可重复性的肾脏类器官。体外制造用于药物研发的类器官时，可靠性和可重复性是至关重要的。为实现这一点，需要探索从不同hpsc细胞系及不同实验批次间稳定获得个体差异小的类器官产物的方法。一项研究证明通过使用“挤出三维细胞生物打印”(cellular extrusionbioprinting)技术，可提高肾脏类器官产物的可重复性，在显著提高通量的同时，也减少了产物间细胞数量，直径和细胞活性的差异。该技术方法的弊端在于对3d打印装置的依赖提高了肾脏类器官的技术门槛与制造成本。
6、因此，本领域迫切需要开发出制备成熟度较高，稳定性较好的肾脏类器官的应用。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对人多潜能干细胞来源的肾脏类器官整体成熟度欠缺、血管化水平不足的问题，提供了一种利用人羊膜上皮细胞(human amnioticepithelial cells,haecs)，在制备肾脏类器官的过程中的应用。
2、本方面的第一方面，提供人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官中的应用，所述制备肾脏类器官的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。
3、上述肾脏类器官分化至第6天到第16天时，与人羊膜上皮细胞共同培养。
4、上述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类器官。
5、上述人羊膜上皮细胞密度为1×104/cm2。
6、上述人多潜能干细胞向肾脏类器官分化的第6天至到第16天期间，持续使用1×104/cm2人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞进行共培养。
7、上述人多潜能干细胞来源的分化产物培养在transwell小室的上层，人羊膜上皮细胞培养在小室下层。
8、本专利技术第二方面，提供人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官疾病模型中的应用，所述制备肾脏类器官疾病模型的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。
9、上述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类器官。
10、上述人多潜能干细胞为携带致病突变的遗传性肾脏病患者的细胞经重编程获得。
11、上述患者的细胞为血液细胞或尿液脱落细胞。
12、上述肾脏类器官疾病为常染色体显性遗传肾小管间质肾病。
13、本专利技术第三方面，提供人羊膜上皮细胞在筛选肾脏类器官疾病的药物中的应用，首先，用人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞制备肾脏类器官疾病模型，然后用所述肾脏类器官疾病模型与不同浓度的目标药物共培养，以正常肾脏类器官与不同浓度的目标药物共培养，分析比对二组的药物毒性和治疗效果，初步判断该目标药物是否具有治疗肾脏类疾病的效果，将有治疗效果的目标药物作为候选药物。
14、本专利技术所述目标药物为可能具有治疗肾脏类器官疾病作用的药物或其他待检测药物。
15、人多潜能干细胞来源的肾脏类器官是体外研究肾脏发育及疾病机制的理想模型，然而现阶段其整体成熟度欠缺、血管化水平以及批次间稳定性不足是制约肾脏类器官应用的瓶颈问题。体外缺乏体内发育所需的精细微环境是造成肾脏类器官与体内肾脏在结构与功能上差距巨大的重要原因。haecs是从胎盘上最靠近胎儿一侧的羊膜上分离而来的一种围产期细胞，可以表达多种细胞因子、免疫调控因子和神经营养因子。有研究证明haecs可作为“信号中心”调节灵长类动物胚胎发育。因此，haecs可为分化过程中的人多潜能干细胞提供模拟体内的发育微环境，应用于肾脏类器官的体外制备。因此，本专利技术首次将haecs应用于体外制备人多潜能干细胞来源的肾脏类器官，并能够促进其结构与功本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官中的应用，其特征在于，所述制备肾脏类器官的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾脏类器官分化至第6天到第16天时，与人羊膜上皮细胞共同培养。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类器官。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞密度为1×104/cm2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人多潜能干细胞向肾脏类器官分化的第6天至到第16天期间，持续使用1×104/cm2人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞进行共培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，人多潜能干细胞来源的分化产物培养在Transwell小室的上层，人羊膜上皮细胞培养在小室下层。
7.人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官疾病模型中的应用，其特征在于，所述制备肾脏类器官疾病模型的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述人多潜能干细胞为携带致病突变的遗传性肾脏病患者的细胞经重编程获得。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述患者的细胞为血液细胞或尿液脱落细胞。
11.人羊膜上皮细胞在筛选肾脏类器官疾病的药物中的应用，其特征在于，首先，用人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞制备肾脏类器官疾病模型，然后用所述肾脏类器官疾病模型与不同浓度的目标药物共培养，以正常肾脏类器官与不同浓度的目标药物共培养，分析比对二组的药物毒性和治疗效果，初步判断该目标药物是否具有治疗肾脏类疾病的效果，将有治疗效果的目标药物作为候选药物。
...【技术特征摘要】
1.人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官中的应用，其特征在于，所述制备肾脏类器官的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾脏类器官分化至第6天到第16天时，与人羊膜上皮细胞共同培养。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类器官。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞密度为1×104/cm2。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人多潜能干细胞向肾脏类器官分化的第6天至到第16天期间，持续使用1×104/cm2人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞进行共培养。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，人多潜能干细胞来源的分化产物培养在transwell小室的上层，人羊膜上皮细胞培养在小室下层。
7.人羊膜上皮细...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨莉，马媛，向晨罡，辛晓红，张传宇，刘琴，
申请(专利权)人：上海赛傲生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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