鉴定水稻籼粳亚种的方法及其专用引物组合物技术

本发明专利技术公开了一种鉴定水稻籼粳亚种的方法及其专用引物组合物。本发明专利技术提供的引物组合物，由如下３个引物对组成：序列表的序列１所示ＤＮＡ和序列表的序列２所示ＤＮＡ组成的引物对ＲＭ１３０；序列表的序列３所示ＤＮＡ和序列表的序列４所示ＤＮＡ组成的引物对ＲＭ７００９；序列表的序列５所示ＤＮＡ和序列表的序列６所示ＤＮＡ组成的引物对ＲＭ７３３７。述引物组合物可用于辅助鉴定水稻籼粳亚种，具有快捷高效、灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点，适用于水稻品种的籼粳属性鉴定、水稻育种以及植物进化研究等方面的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鉴定水稻籼粳亚种的方法及其专用弓I物组合物。
技术介绍
籼粳分化是亚洲栽培稻遗传分化的主流，而且籼粳亚种在多方面都表现出很大差 异。因此，籼粳亚种间杂种优势的利用是水稻超高产育种的一项很重要的手段，直接利用籼 粳间杂种优势已成为杂交育种的主攻方向。要进行籼粳亚种间杂种优势的超高产育种，首 先是正确判别籼粳。籼粳中间型或非典型籼粳可能来源于籼粳的自然杂交或人工杂交，也 可能来源于分化前的原始型过渡品种。这些品种中有很多是广亲和材料，如果能够正确认 识其在分类系统中的地位，利用这些品种作为籼粳杂交的中间桥梁，运用科学的育种方法， 减少或避免亚种间产生不育或育性较差的问题，对籼粳稻杂种优势的利用、广亲和材料的 选育、分子标记及基因工程的顺利进行都具有很重要的意义。随着科学技术的不断发展和深入，许多学者试图利用现代科学方法系统直观 地判别籼粳，以期能简单方便地进行分类。加藤等以形态特征、杂交亲和性与血清反应 为依据，提出了稃毛、粒形和亲和性等作为籼粳鉴别的性状；R彦一等则采用判别函数Y =-K+0. 75C-0. 22H+0. 86ph来判别籼粳(K为对氯酸钾的抵抗力；C为低温致害程度；H为颖 尖稃毛长度；Ph为对苯酚的反应)。这两种方法对于典型的籼粳稻是很适应的，但对于某些 地区一些类型亲缘关系复杂，分类上就易产生错误。程侃生提出的程式指数分类法，是以稃 毛、抽穗时壳色、叶毛、酚反应、第1-2穗节长和谷粒长宽比6个性状为鉴别指标，将每个性 状区分为5个等级，经数字量化后以其综合得分值划分为籼、偏籼、偏粳和粳型4类，到目前 为止是我国广泛采用的籼粳形态鉴别法(请参见程侃声.亚洲稻籼粳亚种的鉴别.云南科 技出版社，昆明，1993)。生物技术的蓬勃发展，使得遗传标记被广泛用于籼粳分类。张尧忠等用稻种酯酶 同工酶聚丙烯酸胺凝胶电泳法进行籼粳分析，发现了籼粳的标志酶带，并且结果与程式分 类法一致，但不能鉴别象光壳稻、镰刀谷等在内的特殊材料。钱惠荣等利用RFLP(扩增片段 长度多态性)技术，筛选出了一批对籼粳特异性具有鉴别能力的RFLP探针，可以用来鉴别 籼粳测验种。程式华等构建了籼粳交群体，结合形态指数法和分子标记法对材料的籼性成 分和粳性成分进行有效鉴别。孙传清等利用RAPD方法，采用35个随机引物对5个籼稻品 种、5个粳稻品种和27份中国普通野生稻进行了分析，60%以上的引物能在籼稻和粳稻基 因组间显示差异。然而，传统分类方法采用的分类标准大都是数量性状，既要求鉴定者经验丰富，具 有准确的观察能力，还要求对鉴定时期的正确选择，使用标准难以把握。RFLP法要经过 Southern杂交，操作复杂，工作量大；一般选用单拷贝探针，标记数量相对较少，多态性较 低；DNA用量多，相对要求DNA较完整；酶切反应，要求DNA纯度较高。RAPD法模板DNA在 扩增时对模板浓度很灵敏，即不同的浓度会出现不同的扩增式样；扩增反应时要求模板尽 量少含杂质；使用低温复性，通常为36°C (温度在36°C以下，小于1°C的变化就会得到完全3不同的扩增式样)，特异性低，引物与模板间有较高的错配率；重复性低，即便同一实验室 也不易重复，不同的实验室间更是缺乏可比性。因此，到目前为止还没有形成一套能直接用 于实际工作中的分类系统。所以，亚洲栽培稻的分类一直受到各国科学家的高度重视，亟待 建立简便易行的分类体系，使之更好地为水稻资源和育种工作服务。SSR标记是建立在PCR基础上的一种新型遗传标记，能够反映植物在遗传物质DNA 水平上的差异，具有较高的多态性信息量，具有共显性分离、标记位点专化性等特点，而且， 操作简单、试验重复性好，已在生物起源、进化、遗传多样性研究和品种资源鉴定中得到广 泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定水稻籼粳亚种的方法及其专用引物组合物。本专利技术提供了辅助鉴定水稻籼粳亚种的引物组合物，由如下3个引物对组成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对RM130 ；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对RM7009 ；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对RM7337。本领域技术人员根据专业知识可以选用以上任一引物对，或是它们的组合，还可 以在合成引物时使引物带上标记，如荧光标记。本专利技术提供的辅助鉴定水稻籼粳亚种的方法，属于微卫星指数法 (MicrosatelliteIndex)，包括下列步骤(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，用引物对RM130进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物甲；以待测水稻的基因组DNA为模板，用引物对RM7009进行PCR扩增，得到PCR扩增 产物乙；以待测水稻的基因组DNA为模板，用引物对RM7337进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物丙；(2)如果PCR扩增产物甲为90bp，赋值为1，如果PCR扩增产物甲为84bp，赋值 为-1 ；如果PCR扩增产物乙为99bp，赋值为1，如果PCR扩增产物乙为96bp，赋值为-1 ；如 果PCR扩增产物丙为134bp，赋值为1，如果PCR扩增产物丙为122bp，赋值为-1 ；(3)将PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙和PCR扩增产物丙的赋值相加，得到和值； 和值大于0的为候选的粳型稻种，和值小于0的为候选的籼型稻种。所述方法中，可采用CTAB法提取水稻的基因组DNA。所述方法中，用于提取基因组的水稻材料可为新鲜的，也可为干品。所述方法中可采用变性胶聚丙烯酰胺凝胶电泳检测所述PCR扩增产物的大小。所 述电泳中，优选采用银染法染色。PCR扩增产物甲、PCR扩增产物乙和PCR扩增产物丙的电泳结果(SSR图谱)可以 采用软件进行分析，也可以目测进行分析。实施例中采用的是15ul PCR反应体系，本领域技术人员可以将反应体系扩大或缩 小，也可以将引物增多或减少。本专利技术还保护一种辅助鉴定水稻籼粳亚种的试剂盒，包括所述引物组合物。所述弓I物组合物，所述方法和所述试剂盒均可以用于水稻育种。所述试剂盒中，还可包括用于提取基因组DNA的试剂和/或用于PCR扩增的试剂。所述试剂盒中的各个组分可为液体，也可为冻干粉。本专利技术基于籼粳亚种DNA重复序列的差异，提供了 3对籼粳特异性分化程度高的 SSR引物对，可用于水稻籼粳亚种的鉴定。本专利技术采用137种水稻样本对本专利技术的引物组合 物和方法进行了验证。所选用的材料有很好的代表性，为用SSR标记进行籼粳鉴别研究提 供了很好的平台。本专利技术具有快捷高效、灵敏度高、分辨力好、结果准确可靠等优点，适用于 水稻品种的籼粳属性鉴定、水稻育种以及植物进化研究等方面的应用。附图说明图1为采用引物RM7009时部分样本的聚丙烯酰胺电泳图。图2为采用引物RM130时部分样本的聚丙烯酰胺电泳图。图3为采用引物RM7337时部分样本的聚丙烯酰胺电泳图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。CTAB 提取液(1000ml)的配方(pH = 8. 0)见本文档来自技高网...

【技术保护点】
辅助鉴定水稻籼粳亚种的引物组合物，由如下３个引物对组成：　　序列表的序列１所示ＤＮＡ和序列表的序列２所示ＤＮＡ组成的引物对ＲＭ１３０；　　序列表的序列３所示ＤＮＡ和序列表的序列４所示ＤＮＡ组成的引物对ＲＭ７００９；　　序列表的序列５所示ＤＮＡ和序列表的序列６所示ＤＮＡ组成的引物对ＲＭ７３３７。

【技术特征摘要】
辅助鉴定水稻籼粳亚种的引物组合物，由如下3个引物对组成序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成的引物对RM130；序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成的引物对RM7009；序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA组成的引物对RM7337。2.辅助鉴定水稻籼粳亚种的方法，包括下列步骤(1)以待测水稻的基因组DNA为模板，用引物对RM130进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物甲；以待测水稻的基因组DNA为模板，用引物对RM7009进行PCR扩增，得到PCR扩增产物 乙；以待测水稻的基因组DNA为模板，用引物对RM7337进行PCR扩增，得到PCR扩增产物丙； 所述引物对RM130由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成；所述引物 对RM7009由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；所述引物对RM7337 由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李自超，张冬玲，张洪亮，王美兴，王凤梅，宋立营，马占峰，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]