一种有核细胞标识方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种有核细胞标识方法及其应用，所述有核细胞标识方法应用于显微操作仪捕获法联合ＬＶ－ＰＣＲ的单细胞分离检测平台和激光显微切割法联合ＬＶ－ＰＣＲ的单细胞分离检测平台，包括：将含有核细胞的检材放入含缓冲液的离心管中，振荡离心管，使检材上的细胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；在细胞悬液加入龙胆紫或苏木素进行染色，所述龙胆紫的终浓度为０．１～０．５μｇ／μｌ，染色时间为２～７分钟；所述苏木素的终浓度为１～７μｇ／μｌ，染色时间为３－７分钟，在上述两个单细胞分离检测平台中使用本发明专利技术所述的细胞标识方法可实现对检材细胞的有效识别，后续的ＬＶ－ＰＣＲ扩增抑制弱，并能获得良好的ＤＮＡ分型结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术以及法医学领域，尤其涉及适用于单细胞分离检测平台的有 核细胞标识方法及其应用。
技术介绍
在刑事案件侦破中，很多都需要法医鉴定的介入。多数情况下，现场所能获得的检 材上通常都是一些疑难混合检材，与研究用的理想检材相比，突出的问题是所获得的检材 中目标细胞数量少，形态变化大，胞核胞浆分界不清，背景复杂。在不进行细胞标识的情况 下，这些检材上的目标细胞无法发现或极易被误认，导致不能获得检材细胞的确定DNA分 型结果，因此对于这些检材必须通过特定和有效的细胞标识方法来对目标细胞进行识别和 分离。为了对目标细胞进行有效识别和分离，目前采用的方法中，对检材细胞进行染色后实 施PCR扩增是必需的操作过程，但面临的问题是，因染料对PCR扩增具有一定程度的抑制， 对于成功捕获的检材细胞最终仍得不到良好的分型结果，不能满足案件分析的需要。虽然国内外学者对基于单细胞分离检验技术平台的细胞标识方法进行了多方面 的研究，但都没有解决染料对PCR扩增产生明显的抑制的问题。有报道研究人员利用显微 捕获仪进行单个细胞DNA样本制备中，采用酸性复红进行细胞悬液染色，通过标识细胞的 胞浆来实现对目标细胞的识别，但该实验采用的染料对PCR扩增产生明显的抑制；也有一些关于利用激光捕获显微切割系统(LCM)从模拟混合精斑样本里分离精 子细胞的研究，采用了五种组织学染色法(HE法、CTS法、AO法、Wright氏法、甲基绿法)对 精子细胞和阴道上皮细胞进行涂片染色，并对标识效果及PCR扩增抑制程度进行比较，虽 然发现HE法和CTS法染色效果相对较好，但两种染色法仍导致一定程度的PCR扩增抑制。虽然使用上述的染色方法基本可以满足对理想检材的检测，但是对于来自事故或 者案件中的微量混合检材，因染料对PCR扩增抑制明显，采用上述染色方法即使获得良好 的细胞标识效果，最终的基因分型结果仍然偏差很大。近年来发展起来的显微操作仪捕获法联合LV-PCR单细胞分离检测平台或激光显 微切割法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台，基于显微镜玻片平面印刷的技术，为捕获到 的单细胞的微量DNA进行扩增提供了最佳微量反应环境，使单细胞分离检测平台的灵敏度 大大提高，理论上讲更加适用于对微量混合检材的扩增分型。针对低体积的扩增体系的检 测需要，在提高单细胞分离检测平台灵敏度的同时，对减少后续PCR扩增抑制提出了更高 的要求，因此如何降低微量扩增体系中染料的抑制作用，以获得混合检材中有核细胞良好 的DNA分型结果成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种有核细胞标识方法，通过对染料种类以及染色时间的确定，在 对检材细胞进行有效识别的同时，后续的LV-PCR扩增抑制弱，并能获得良好的DNA分型结 果，更适于应用于显微操作仪捕获法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台和激光显微切割法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台，取得提高的DNA分型效率。本专利技术进一步还提供了对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的方法，应用于显 微操作仪捕获法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台和激光显微切割法联合LV-PCR的单细 胞分离检测平台，达到提高DNA分型的准确性的目的。本专利技术提供了一种有核细胞标识方法，该方法包括将含上述有核细胞的检材放入含有适量缓冲液的离心管中，振荡离心管使其上的 细胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；将龙胆紫或苏木素加入上述细胞悬液，进行染色；所述龙胆紫的终浓度为0. 1 0. 5 μ g/μ 1，染色时间为2 7分钟；所述苏木素的终浓度为1 7μ g/μ 1，染色时间为 3 7分钟；对上述染色后的细胞悬液中的有核细胞利用显微镜进行观察和识别。本专利技术提供的上述有核细胞标识方法的具体实施方案中，龙胆紫的配制和保存 方法可以为将5g龙胆紫晶体加入IOml的95%乙醇中溶解，添加灭菌后的去离子水至 100ml，将配好的龙胆紫染液放入棕色瓶密封保存，在1月内使用。当然，也可以按照其他适 当方法进行配制和保存。苏木素的配置方法将Ig苏木素溶于IOml无水酒精中，加热溶解，另将20g硫酸 铝钾和200ml蒸馏水放入较大的三角烧瓶中加温并搅拌，待全部溶解后，再倒入苏木素酒 精溶液，混合后煮沸1分钟，稍冷却，慢慢加入0. 5g红色氧化汞0. 5g，改用小火加温，当染液 变为紫红色时，将烧瓶浸入冷水中，使染液迅速冷却，冷却后过滤即可使用。所述有核细胞的检材可以选择为含口腔粘膜上皮细胞与表皮细胞的混合细胞的 检材，或含精子细胞和阴道上皮细胞的混合细胞的检材，也可以选择其它能提供有核细胞 的检材，即，本专利技术方法既适用于目前研究中常用的“理想检材”(用于研究的具有细胞结构 完整、胞核明显、与胞浆分界清楚的检材，通常不含杂质，镜下易于分辨的检材)；也适用于 其他来自事故或案件的混合检材；尤其是对这些来自事故或案件的混合检材，使用本专利技术 的细胞标识方法进行标识，解决了后续的PCR扩增抑制和分型困难的问题，在法医学上对 提高未知检材的DNA分型准确性有重要的意义。本专利技术的一个实施例中，所述有核细胞的检材为含口腔粘膜上皮细胞与表皮细胞 的混合细胞的检材，染色时龙胆紫的终浓度为0. 2 0. 3 μ g//μ 1，染色时间为3 5分钟 左右；染色时苏木素的终浓度为3 6μ g/μ 1，染色时间为3 5分钟。本专利技术的另一个实施例中，所述有核细胞的检材为含精子细胞和阴道上皮细胞的 混合细胞的检材，染色时龙胆紫的终浓度为0. 15 0. 35 μ g/ μ 1，染色时间为4 7分钟左 右；染色时苏木素的终浓度为4. 5 7μ g/μ 1，染色时间为4 7分钟。需要说明的是，由于从事故或案件的混合检材上获得的细胞量极其微少，一般无 法确定准确的细胞含量，因此，本专利技术方法对于龙胆紫或苏木素使用量的确定可以最终的 细胞悬液的体积为基准，即使产生误差也都在可忽略范畴内，不会明显影响最终结果，但可 以方便操作。本专利技术提供的上述有核细胞标识方法，所述的缓冲液可以是常规的能使细胞从组 织上脱离的溶液，例如，TNE 缓冲液=IOmM ρΗ 8. 0 的 Tris-HCl, IOmMNaCl,0. 5Mm EDTA0基于上述方法，本专利技术还提供了所述有核细胞标识方法在使用显微操作仪捕获法联合LV-PCR的单细胞分离检测平台和在激光显微切割法联合LV-PCR的单细胞分离检测平 台中对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的应用。本专利技术的另一方面，提供了一种利用显微操作仪捕获法联合LV-PCR单细胞分离 检测平台对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的方法，该方法包括将获得的含上述有核细胞的检材放入含有适量缓冲液的离心管中，振荡离心管， 使检材上的细胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；将龙胆紫或苏木素加入上述细胞悬液，室温(约15 25°C )下进行染色；所述龙 胆紫的终浓度为0. 1 0. 5 μ g/μ 1，染色时间为2 7分钟；所述苏木素的终浓度为1 7 μ g/ μ 1，染色时间为3 7分钟；将灭菌后的载玻片置于显微镜载物台上，吸取适量的上述染色后的细胞悬液滴加 到载玻片上，使用显微操作仪捕获单个检材细胞；把捕获的细胞置于低体积扩增反应玻片上，利用荧光标记复合扩增试剂盒进行 LV-PCR 扩增；扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有核细胞标识方法，其特征在于，该方法包括：　　将含上述有核细胞的检材放入含有缓冲液的离心管中，振荡离心管，使检材上的细胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；　　将龙胆紫或苏木素加入上述细胞悬液，进行染色；所述龙胆紫的终浓度为０．１～０．５μｇ／μｌ，染色时间为２～７分钟；所述苏木素的终浓度为１～７μｇ／μｌ，染色时间为３－７分钟；　　对上述染色后的细胞悬液中的有核细胞利用显微镜进行观察和识别。

【技术特征摘要】
一种有核细胞标识方法，其特征在于，该方法包括将含上述有核细胞的检材放入含有缓冲液的离心管中，振荡离心管，使检材上的细胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；将龙胆紫或苏木素加入上述细胞悬液，进行染色；所述龙胆紫的终浓度为0.1～0.5μg/μl，染色时间为2～7分钟；所述苏木素的终浓度为1～7μg/μl，染色时间为3 7分钟；对上述染色后的细胞悬液中的有核细胞利用显微镜进行观察和识别。2.根据权利要求1所述的有核细胞标识方法，所述有核细胞的检材为含口腔粘膜上皮 细胞与表皮细胞的混合细胞的检材，或含精子细胞和阴道上皮细胞的混合细胞的检材。3.根据权利要求2所述的有核细胞标识方法，所述有核细胞的检材为含口腔粘膜上皮 细胞与表皮细胞的混合细胞的检材，所述龙胆紫的终浓度为0. 2 0. 3 μ g/μ 1，染色时间 为3 5分钟；所述苏木素的终浓度为3 6μ g/μ 1，染色时间为3 5分钟。4.根据权利要求2所述的有核细胞标识方法，所述有核细胞的检材为含精子细胞和阴 道上皮细胞的混合细胞的检材，所述龙胆紫的终浓度0. 15 0. 35 μ g/ μ 1，染色时间为4 7分钟；所述苏木素的终浓度为4. 5 7μ g/μ 1，染色时间为4 7分钟。5.权利要求1-4任一项所述的有核细胞标识方法在使用显微操作仪捕获法联合 LV-PCR的单细胞分离检测平台对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的应用。6.权利要求1-4任一项所述的有核细胞标识方法在激光显微切割法联合LV-PCR的单 细胞分离检测平台中对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的应用。7.—种对混合检材中的有核细胞进行DNA分型的方法，该方法包括将获得的含有核细胞的检材放入含有缓冲液的离心管中，振荡离心管，使检材上的细 胞脱落，获得检材细胞的细胞悬液；将龙胆紫或苏木素加入上述细胞悬液，进行染色；所述龙胆紫的终浓度为0. 1 0. 5μ g/μ 1，染色时间为2 7分钟；所述苏木素的终浓度为1 7μ g/μ 1，染色时间为 3 7分钟；将灭菌后的载玻片置于显微镜载物台上，吸取上述染色后的细胞悬液滴加到载玻片 上，使用显微操作仪捕获单个...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彩霞，胡兰，朱典，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]