【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及利用piggybac转座系统构建稳定基因敲低细胞株的构建方法。
技术介绍
1、遗传操作技术是研究基因功能的重要技术手段，其中最常用的手段就是在目标细胞中敲低该基因，并获得稳定基因敲低细胞株。目前主要是利用病毒法构建稳定基因敲低细胞株，其中最常用的是慢病毒，已经得到了广泛的应用。
2、通过设计靶基因敲低的慢病毒载体，并将其进行慢病毒包装和病毒滴度测定，慢病毒可以在感染细胞后，将靶基因敲低片段整合至受感染细胞的基因组中，并在细胞中稳定地敲低靶基因。利用慢病毒构建稳定基因敲低细胞株具有一些缺点：(1)在基因组中整合位置随机，可能会造成内源基因表达异常。(2)步骤较为繁琐，构建稳定敲低细胞株周期较长。(3)细胞受到病毒感染，可能影响细胞状态。
3、因此，需要一种高效构建稳定基因敲低细胞株的方法。piggybac转座系统可将特定dna序列插入到真核细胞基因组中，其体系包括末端反向重复序列(inverted terminalrepeat,itr)和piggybac转座酶。piggybac转座系统具有以下优点：(1)整合位点为真核基因组的“ttaa”序列，一般不会造成内源基因表达异常。(2)步骤简单，通过质粒构建和细胞转染即可实现。(3)采用“剪切-粘贴”模式进行转座，效率较高。可将靶基因敲低片段构建至itr序列之间，利用piggybac转座系统构建稳定基因敲低细胞株。
4、目前，已有提出利用piggybac转座系统构建稳定基因敲低细胞株。例如，中国专利cn109628488a提
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种利用piggybac转座系统构建稳定基因敲低细胞株的方法。
2、为达到以上目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1.利用piggybac转座系统构建稳定基因敲低细胞株的方法，具体步骤如下：
4、(1)将包含多克隆位点和u6启动子的基因合成序列通过同源重组将piggybacdual promoter载体中的cmv启动子替换，得到pb-u6p载体。
5、(2)将靶标基因的敲低片段连接到步骤(1)中的pb-u6p载体，位于u6启动子下游，即可构建成基因敲低载体pb-u6p-shgene。
6、(3)将pb-u6p-shgene和super piggybac transposase载体混合后，转染至细胞株中。利用嘌呤霉素进行稳转细胞株筛选。
7、(4)对步骤(3)中稳转细胞株进行rt-qpcr和western blot检测，鉴定目标基因敲低的效果。
8、作为优选技术方案之一，步骤(1)中，所述基因合成序列包括u6启动子和多克隆位点，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
9、作为优选技术方案之一，步骤(1)中，多克隆位点和u6启动子序列通过同源重组的方式连接至piggybac dual promoter载体的speⅰ/bamhⅰ位点。
10、作为优选技术方案之一，步骤(1)中，所述pb-u6p载体，其核苷酸序列如seq idno.2所示。
11、作为优选技术方案之一，步骤(2)中，基因敲低片段为基因的sirna发夹结构片段，并具有以下规律：片段的5‘端序列为ccgg，片段的3‘端序列为tttttg。
12、作为优选技术方案之一，步骤(2)中，基因敲低片段通过同源重组的方式连接至pb-u6p载体的ecorrⅰ/bamhⅰ位点。
13、作为优选技术方案之一，步骤(3)中，pb-u6p-shgene和super piggybactransposase载体按照摩尔比1：1混合。
14、作为优选技术方案之一，步骤(3)中，转染方法为脂质体转染法。
15、作为优选技术方案之一，piggybac dual promoter载体来自淼灵生物科技有限公司p0178产品。
16、作为优选技术方案之一，super piggybac transposase载体来自淼灵生物科技有限公司p0179产品。
17、2、本专利技术中构建稳定基因敲低细胞株方法的优点包括：
18、(1)整合位点为真核基因组的“ttaa”序列，一般不会造成内源基因表达异常。
19、(2)步骤简单，通过质粒构建和细胞转染即可实现。
20、(3)采用“剪切-粘贴”模式进行转座，效率较高。
21、(4)采用u6启动子表达小片段，可有效形成sirna茎环结构，基因敲低效率高。
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1.利用PiggyBac转座系统构建稳定基因敲低细胞株的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因合成序列包括U6启动子和多克隆位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，U6启动子序列通过同源重组的方式连接至PiggyBac Dual promoter载体的SpeⅠ/BamHⅠ位点。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述PB-U6P载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，基因敲低片段为基因的siRNA发夹结构片段，并具有以下规律：片段的5‘端序列为CCGG，片段的3‘端序列为TTTTTG。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，基因敲低片段通过同源重组的方式连接至PB-U6P载体的EcorRⅠ/BamHⅠ位点。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，转染方法为脂质体转染法。
9.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，PiggyBac Dual promoter载体来自淼灵生物科技有限公司P0178产品。
10.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，Super PiggyBac Transposase载体来自淼灵生物科技有限公司P0179产品。
...【技术特征摘要】
1.利用piggybac转座系统构建稳定基因敲低细胞株的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述基因合成序列包括u6启动子和多克隆位点，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，u6启动子序列通过同源重组的方式连接至piggybac dual promoter载体的speⅰ/bamhⅰ位点。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pb-u6p载体，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，基因敲低片段为基因的sirna发夹结构片段，并具有以下规律：片段的5‘端序列为ccgg，片段的3‘端序列为...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宗灵，易三桂，谢德龙，农嵩，胡红柳，
申请(专利权)人：右江民族医学院，
类型：发明
国别省市：
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