一种酶法合成Ｇａｌ－ｓｏｒｂｉｔｏｌ的方法技术

本发明专利技术专利是一种酶法制备Ｇａｌ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ的方法。对于糖醇的合成，工业上采用的是传统的化学方法。需要在高温、高压的环境下进行，造成其在基本建设投资及操作费用上花费较高，同时高压氢气易燃易爆容易造成安全隐患，其催化剂在产品安全性方面也存在一定的问题，并且还会造成严重的环境污染。本发明专利技术以乳糖和山梨糖醇作为底物，由来源于环状芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ?ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ?ｏｒｙｚａｅ）或青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ?ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）等的β－Ｄ－半乳糖苷酶作为催化剂，通过催化合成、柱层析制备得到乳糖醇的同分异构体——Ｇａｌ－β－（１→３）Ｓｏｒｂｉｔｏｌ。体外发酵实验表明Ｇａｌ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ具有益生作用。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法合成Ga卜sorbitol的方法技术路线本专利技术涉及一种Gal-Sorbitol的酶法制备方法，具体地说是一种利用β -D-半乳 糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成Gal-Sorbitol的方法。
技术介绍
低聚糖(Oligosaccharides)是指由2 10个单糖组成的糖类，广泛存在于各种 天然食物中。其中，功能性低聚糖具有某些独特的生理活性，包括低甜度、低热量，难以被 人体消化吸收，食用后基本不增加血糖、血脂并能防止龋齿发生。糖醇是一种多元醇，一般 具有与功能性低聚糖类似的生理功能和物理特性。一般来说糖醇含有两个以上的羟基，可 以由来源广泛的、相应的糖来制取，即将糖分子上的醛基或酮基还原成羟基而成糖醇。国外 把糖醇作为食糖替代品，广泛应用于食品工业，添加糖醇的甜食品称为无糖食品。糖醇因不 被口腔中微生物利用，又不使口腔PH降低，反而会上升，所以不腐蚀牙齿，是防龋齿的好材 料，糖醇对人体血糖值上升无影响且能为糖尿病人提供一定热量，所以可作为糖尿病人提 供热量的营养性甜味剂。对于糖醇的合成，工业上采用的是传统的化学方法。化学法合成需要在高温、高压 的环境下进行，造成其在基本建设投资及操作费用上花费较高，同时高压氢气易燃易爆容 易造成安全隐患，再加上用镍作为催化剂在产品安全性方面也存在一定的问题，并且还会 造成严重的环境污染，总体来说化学方法的工业化生产糖醇存在诸多的不足之处。近年来，一些科学们尝试采用酶法合成一些双糖醇。Klewicki (2000年)利用 脆壁克鲁维酵母的0-0-半乳糖苷酶的水解和转糖苷基作用合成了631-吐7让1~^01、 Gal-xylitol 等。乳糖醇是一种双糖醇，具有比乳糖稳定，味觉和特性接近于砂糖等性质，其代谢与 胰岛素无关，不增加血糖浓度，可供糖尿病人食用；同时，乳糖醇能促进人体肠道有益菌增 殖，具有低能量、低致龋齿性等特点。目前，在食品和医药领域已经得到广泛的应用。作为 乳糖醇的同分异构体Gal-Sorbitol也应该存在潜在的生理功能和应用，但国际上对其相 关研究很少。
技术实现思路
本专利技术的目的是采用利用β-D-半乳糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成 Gal-Sorbitol ο本专利技术的技术方案包括利用β -D-半乳糖苷酶来催化合成反应，通过HPLC法检测 各种反应产物。HPLC法无法确定的产物通过进一步的分离纯化后，进行1H-NMK13C-NMR和 ESI-TOF-MS分析确定其结构组成。本专利技术专利以乳糖和山梨糖醇作为底物，由β-D-半乳糖苷酶来催化合成反应， 得到乳糖醇的同分异构体——Gal-β-(1 — 3) sorbitol。附图说明图1为β -D-半乳糖苷酶催化合成Gal-Sorbitol的酶反应液中糖类组成的典型 HPLC图谱图2 为 Gal-Sorbitol 的质谱 3 为 Gal-Sorbitol 的 1H-NMR 图谱图 4 为 Gal-Sorbitol 的 13C-NMR 图谱具体实施例方式1、酶法合成反应称取0. 4g乳糖和0. 2g山梨糖醇置于螺口瓶中，再加入一定量蒸馏水后进行高压 处理(12rC，20min)，使其完全溶解得到过饱和溶液，自然冷却至反应温度40°C。然后加入 适量的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(PH6.0)和蒸馏水调整溶液浓度至40% (w/v) 0称取一定量 的半乳糖苷酶(3U/mL)加入上述体系并置于40°C水浴中开始反应，然后每隔一定时间 取样，沸水浴IOmin使酶灭活。用纯净水稀释一定倍数以后，进行HPLC分析。2、反应产物的测定方法采用HPLC外标法测定产物的含量。(1)糖标准溶液的制备。准确称取Gal-Sorbitol (经纯化得到)的标准样品，用 水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同浓度梯度的标准溶液，经0. 45 μ m滤膜过滤 后，按浓度从低到高的顺序进HPLC检测，记录各个浓度对应的峰面积，以各个浓度及其对 应峰面积作图，得到各个糖的标准曲线。(2)色谱条件。色谱柱Sugar-D (4. 6X 250mm，5 μ m，Nacalai Tesque Inc.，日本)； 柱温:40°C ；流动相乙腈水=75 25 (ν/ν)；流速1. OmL/min ；进样量:20μ L。(3)根据糖标样的标准曲线，计算各种糖含量。3、反应产物Gal-sorbitol的纯化与结构鉴定经HPLC分析，Gal-Sorbitol是合成反应的主要产物，由于这是一种新型合成的 物质，无法确定其结构组成。因此对Gal-Sorbitol进行分离纯化，纯化得到的样品进行 1H-NMR, 13C-NMR和ESI-TOF-MS分析确定其结构组成。反应进行到4h以后，沸水浴IOmin中止反应。反应液加适量的去离子水稀释后， 经0.45 μ m滤膜过滤，滤液过活性炭-硅藻土(1 1, w/w)中压层析柱。层析柱用一系列 线性浓度梯度(0% 40%)的乙醇进行洗脱，洗脱液经苯酚硫酸法初步检测后，收集其中 含糖的洗脱液，进一步通过HPLC检测各峰洗脱液中的糖组分。收集Gal-Sorbitol组分，合 并、浓缩、干燥。纯化得到的Gal-Sorbitol样品进行1H-NMRj3C-NMR和ESI-TOF-MS分析， 1H-NMK13C-NMR分析时以D2O为溶剂，四甲基硅烷为内标。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的合成Ｇａｌ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ的方法，其特征是利用乳糖和山梨糖醇为底物，在β－Ｄ－半乳糖苷酶的催化下合成Ｇａｌ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ，并分离纯化产物Ｇａｌ－Ｓｏｒｂｉｔｏｌ。

【技术特征摘要】
一种新型的合成Gal Sorbitol的方法，其特征是利用乳糖和山梨糖醇为底物，在β D 半乳糖苷酶的催化下合成Gal Sorbitol，并分离纯化产物Gal Sorbitol。2.根据权利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于底物的浓度为40%， 而且底物乳糖和山梨糖醇的起始浓度比为1 1。3.根据权利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于利用β-D-半乳糖苷 酶制备Gal-Sorbitol时，适宜的反应条件为反应温度40°C，ρΗ为6. 0，酶量为3U/mL，反应 时间为4小时。4.根据权利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾晓雄，唐淑芬，叶红，李伟，孙怡，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[]