【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞分子生物领域，涉及一种优化的肠道样本预处理和两步法解离制备单细胞悬液的方法及其应用。
技术介绍
1、肠道既是人体重要的消化器官，也是人体最大的免疫器官。肠壁分为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜四层。黏膜层是最靠近管腔的一层，由上皮、固有层和黏膜肌层组成。肠道上皮细胞可分为6种分化的细胞谱系，包括肠细胞、m细胞、杯状细胞、潘氏细胞、tuft细胞和肠内分泌细胞，这些细胞各有不同的功能。肠道有人体最大的免疫细胞群体，与多种疾病息息相关。肠道主要免疫细胞是肠上皮内淋巴细胞和固有层淋巴细胞。肠上皮内淋巴细胞是机体内最大的淋巴细胞群，约90％是cd3+t细胞，其中一半为cd3+cd8+t细胞，可通过fas受体诱导细胞凋亡来清除入侵病原，并分泌细胞因子调节肠道上皮细胞和固有层淋巴细胞功能。另外，肠道上皮细胞还具有促进t细胞存活、巡逻和保护宿主的机制。固有层白细胞主要包括树突细胞、分泌iga的浆细胞、t细胞和固有淋巴样细胞(ilc)等。此外，粘膜肌层的平滑肌和分布在黏膜下层的肠壁神经丛也是一些研究者关注的组织类型。
2、与传统bulk测序相比，单细胞测序可以有效解决组织间异质性问题，并有助于发现新的稀有细胞类型。经过近几年的高速发展，单细胞测序逐渐成为医学和生物学研究中常用的研究手段，已广泛应用于人和小鼠的不同器官、不同组织的多种疾病研究中。高通量单细胞测序技术的实现有赖于高质量单细胞悬液的制备。肠道(尤其是结直肠)是人类炎症和癌症等疾病易发部位，也是免疫微环境等多因子研究的重要组织部位，是包括人、小鼠、大鼠、昆虫、鱼
3、将新鲜采集的样本立即进行组织固定使细胞内生物大分子维持采集时所处的状态，可以有效避免以上问题的发生。但常用的组织固定液如福尔马林或多聚甲醛会导致细胞中rna降解，无法采用基于polya捕获的单细胞转录组测序平台，如10x genomicschromium、bd rhapsody、mobinova等；醇类(如甲醇、乙醇)固定不会导致rna降解，但易导致样本问题(乙醇固定的样本偏硬易皱缩)或捕获上的偏好性(甲醇固定的样本中高gc含量的基因检出偏少)。dsp(thermo scientific，lot#22585)是一种同型双功能n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs酯)交联剂，具有硫醇可切割性和伯胺反应性，适用于多种应用，如免疫沉淀chip。dsp在8个碳原子间隔臂的每端有一个胺反应性nhs酯。nhs酯在ph值7–9的条件下与伯胺反应可形成稳定的酰胺键，并释放n-羟基琥珀酰亚胺。dsp可穿透细胞膜进行胞内的蛋白交联而不破坏rna。37℃条件下，用10-50mm dtt可以切割间隔臂中的二硫键而使蛋白解交联。dtt是一种还原剂，在单细胞测序反转录体系中被用于抑制rnase作用，防止rna降解。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种样本固定的肠道样本预处理方式和优化的解离结肠组织、获得高细胞活率和丰富细胞类型的用于单细胞测序的单细胞悬液制备方法及应用。
2、本专利技术中，将dsp用于肠道样本采集后立即固定以保持细胞内核酸和蛋白的分子状态，并利用单细胞测序的反转录体系中的dtt对dsp形成的二硫键进行切割从而解除蛋白分子之间的交联作用，mrna的反转录不受影响。另外，在已有的肠道样本两步法解离的基础上，对解离实验体系(酶的组合)和流程进行了优化，将解离时间控制在2.5h以内，并能够获得稳定且细胞类型丰富的解离结果。
3、本专利技术提出的样本固定的肠道样本预处理方式和两步法肠道组织单细胞悬液制备方法，首先将采集并清洗好的肠道组织用含二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)(dsp)的pbs固定交联后保存于美天旎组织保护液(miltenyi，130-100-008)中，肠道组织细胞内核酸和蛋白的分子状态被固定，固定条件为室温固定20-40min；加入tris-hcl ph 7.5停止固定，清洗组织并转移，2-8℃保存并于48h内解离。组织解离采用两步法，先用含edta的消化液i消化，使上皮层与固有层分离开；将固有层组织剪碎并用含有弹性蛋白酶、胶原酶、dnase i的消化液ii消化；在固有层消化期间，用tryple处理上皮层细胞；然后将得到的上皮层细胞和固有层细胞分别进行红细胞裂解和细胞清洗后，进行镜检计数和特定细胞比例混合上机。
4、所述消化液i为含有edta(乙二胺四乙酸二钠)的消化液，其包括但不限于作为溶剂的hank's平衡盐溶液(hbss)、8-15mm edta、8-12mm hepes、1-10％(w/v)fbs。优选地，edta的浓度为10mm，hepes的浓度为10mm，fbs的浓度为2％(w/v)。
5、所述消化液ii为含有弹性蛋白酶、胶原酶、脱氧核糖核苷酸酶i(dnase i)的消化液，其包括但不限于dmem培养基、0.02％-0.2％弹性蛋白酶、0.1％-0.3％胶原酶ii和0.1％-0.3％胶原酶iv、20-50u/mldnase i。优选地，弹性蛋白酶的浓度为0.1％，胶原酶ii的浓度为0.2％，胶原酶iv的浓度为0.2％，dnase i的浓度为30u/ml。此处的百分比均表示质量体积比(w/v)；所述消化液ii中的脱氧核糖核苷酸酶i的作用是降解死亡破裂细胞释放出来的dna，减少细胞结团，提供细胞悬液质量，是单细胞解离中的常用试剂。
6、具体地，消化液i的消化条件为37℃、22rpm，所述消化液i消化时间为15-30min。优选地，消化20min。
7、具体地，消化液ii的消化条件为37℃、22rpm，所述消化液ii消化时间为25-45min。优选地，消化30min。
8、优选地，用tryple(thermofisher，lot#12604013)对消化液i解离得到的上皮细胞层进一步消化10-15min；优选地，消化15min。
9、本专利技术提出的方法，通过用dsp进行样本固定预处理提高了肠道样本中脆弱细胞类型的稳定性并减少本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肠道样本预处理和两步法制备单细胞悬液的方法，其特征在于，所述方法包括：将采集并清洗好的肠道组织用含有二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)的PBS溶液固定后再放入组织保存液中保存，用含EDTA的消化液I消化肠道组织，使上皮层与固有层分离开；将固有层组织剪碎并用消化液II消化；在固有层消化期间用TrypLE处理上皮层细胞；然后，将得到的上皮层细胞和固有层细胞分别进行红细胞裂解和细胞清洗，进行镜检计数和特定细胞比例混合上机。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：样本采集与固定、样本保存、上皮细胞解离、固有层细胞解离、上皮细胞继续消化、镜检计数、最终重悬和细胞混合上机。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，用EDTA消化将上皮细胞和隐窝从组织上剥离下来，再利用TrypLE进行10-15min处理，使未完全分散开的隐窝细胞团解离成单细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)的浓度为0.5-1.5mg/mL；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二硫双(琥珀酰亚
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用消化液I消化解离肠道组织时，将保存在组织保护液中的肠道组织取出，清洗、消化、静置，获得上清；所述消化条件为37℃、22rpm，消化时间为15-30min。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用消化液II中的弹性蛋白酶、胶原酶和脱氧核糖核苷酸酶I将肠道组织中的固有层消化解离成单细胞；所述胶原酶包括胶原酶II和胶原酶IV；所述消化条件为37℃、22rpm，消化时间为25-45min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在≤2.5h内完成。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法获得的单细胞悬液的细胞活率＞80％。
10.如权要求1-9之任一项所述方法在单细胞测序、单细胞悬液制备、肠道原代细胞解离、单细胞流式分析或分选、肠道原代细胞培养中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种肠道样本预处理和两步法制备单细胞悬液的方法，其特征在于，所述方法包括：将采集并清洗好的肠道组织用含有二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)的pbs溶液固定后再放入组织保存液中保存，用含edta的消化液i消化肠道组织，使上皮层与固有层分离开；将固有层组织剪碎并用消化液ii消化；在固有层消化期间用tryple处理上皮层细胞；然后，将得到的上皮层细胞和固有层细胞分别进行红细胞裂解和细胞清洗，进行镜检计数和特定细胞比例混合上机。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：样本采集与固定、样本保存、上皮细胞解离、固有层细胞解离、上皮细胞继续消化、镜检计数、最终重悬和细胞混合上机。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，用edta消化将上皮细胞和隐窝从组织上剥离下来，再利用tryple进行10-15min处理，使未完全分散开的隐窝细胞团解离成单细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)的浓度为0.5-1.5mg/ml；
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二硫...
【专利技术属性】
技术研发人员：王翠亭，张志明，赵仕兰，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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