【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，具体涉及一步转酯反应介导的rna体外环化方法及应用。
技术介绍
1、环形rna(circular rna，circrna)是一类重要的调控性非编码rna，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，其含量丰富、性质稳定、不易降解，并且可以通过多种机制调控基因表达。环形rna最早在上世纪70年代被人们发现，但是限于当时的技术，研究人员无法对其进行深入的研究。近年来，随着相关技术的发展，人们对环状rna的研究逐步深入。目前发现的环形rna可以分为三类：一是由外显子通过反向剪接(back-splicing)形成的外显子来源的环形rna，exonic circrnas；二是由来源于内含子区域通过抑制脱分支过程形成的内含子来源的环形rna，cirnas(circular intronicrnas)；三是由外显子和内含子共同组成的环形rna分子。且研究者在病毒、酵母、果蝇、线虫、小鼠、猴子以及人体中均发现了环状rna的存在，且环状rna由于其闭合的结构，能够使其稳定的存在并不断的积累，避免被降解线性rna的机制降解。
2、为了更好的研究环状rna的性质以及将其更好的利用起来，研究者一直在研究环状rna的体内或者是体外的合成方法，例如专利技术专利cn112662659a公开了一种普适性的mrna体外环化方法，步骤为：制备纯化的mrna；对mrna的5’端进行单磷酸化修饰，并在3’端加上poly(a)；将修饰后的mrna与dna splint杂交；向杂交反应体系中加入t4 dna连接酶进行环化；
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种减少环化步骤和体外环化所需的原料，降低成本，且提高环化效率的可转录成环状rna的载体，具体包括以下内容：
2、第一方面，本专利技术提供了一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
3、a.intron：内含子片段；
4、b.e2：内含子片段的下游exon序列；
5、c.5'同源臂序列；
6、d.3'同源臂序列；
7、e.e1：内含子片段的上游exon序列；
8、所述intron、e2、e1来自同一基因；
9、在所述元件c和d之间插入目的基因序列后，以所述多聚核苷酸序列/载体为基础得到的体外转录模板在体外转录反应中形成环状rna。
10、优选地，所述intron为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段；所述e2为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段下游的exon序列；所述e1为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段上游的exon序列。
11、优选地，所述e2为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段下游8-51个碱基大小的exon序列；所述e1为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段上游2-15个碱基大小的exon序列。
12、优选地，所述intron序列如seq id no.1所示；所述e2序列如seq id no.2-9任一所示；所述e1序列如seq id no.12-19任一所示。
13、所述intron元件前还包括启动子元件，所述启动子元件启动多聚核苷酸序列/载体的体外转录。
14、优选地，所述启动子包括t7启动子、t3启动子、sp6启动子。
15、第二方面，本专利技术提供了一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
16、a.intron：内含子片段；
17、b.e2：内含子片段下游的exon序列；
18、c.5'同源臂序列；
19、d.ires序列；
20、e.3'同源臂序列；
21、f.e1：内含子片段上游的exon序列；
22、所述intron、e2、e1来自同一基因；
23、在所述元件d和e之间插入目的基因序列后，所述多聚核苷酸序列/载体即可在体外转录形成可翻译的或具有生物学活性的环状rna。
24、优选地，所述intron为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段；所述e2为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段下游的exon序列；所述e1为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段上游的exon序列。
25、优选地，所述e2为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段下游8-51个碱基大小的exon序列；所述e1为鱼腥藻属pre-trnaleu基因内含子片段上游2-15个碱基大小的exon序列。
26、优选地，所述intron序列如seq id no.1所示；所述e2序列如seq id no.2-9任一所示；所述e1序列如seq id no.12-19任一所示。
27、所述intron元件前还包括启动子元件，所述启动子元件启动多聚核苷酸序列/载体的体外转录。
28、优选地，所述启动子包括t7启动子、t3启动子、sp6启动子。
29、优选地，所述ires选自以下的ires序列：taura综合征病毒、吸血猎蝽病毒、泰累尔氏脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生症病毒、福曼脊髓灰质炎病毒1、大豆尺蠖病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、虱p病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、gb型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻病毒、茶尺蠖样病毒、脑心肌炎病毒(emcv)、果蝇c病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、芙蓉枯黄环斑病毒、猪瘟病毒、人类fgf2、人类sftpa1、人类amll/runxl、果蝇触角足、人类aqp4、人类at1r、人类bag-1、人类bcl2、人类bip、人类c-iapl、人类c-myc、人类eif4g、小鼠ndst4l、人类lef1、小鼠hif1α、人类n.myc、小鼠gtx、人类p27kipl、人本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
2.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
3.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
4.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
5.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
6.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
7.一种用于体外转录形成环状RNA的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
8.一种用于体
9.如权利要求2-3或权利要求7-8任一所述的多聚核苷酸序列/载体，其特征在于，所述IRES选自以下的IRES序列：Taura综合征病毒、吸血猎蝽病毒、泰累尔氏脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生症病毒、福曼脊髓灰质炎病毒1、大豆尺蠖病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、虱P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻病毒、茶尺蠖样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、芙蓉枯黄环斑病毒、猪瘟病毒、人类FGF2、人类SFTPA1、人类AMLl/RUNXl、果蝇触角足、人类AQP4、人类AT1R、人类BAG-1、人类BCL2、人类BiP、人类c-IAPl、人类c-myc、人类eIF4G、小鼠NDST4L、人类LEF1、小鼠HIF1α、人类n.myc、小鼠Gtx、人类p27kipl、人类PDGF2/c-sis、人类p53、人类Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、唾液病毒、柯萨病毒、双埃柯病毒、人类UNR、小鼠UtrA、人类VEGF-A、人类XIAP、果蝇hairless、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、人类c-src、人类FGF-1、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁绉缩病病毒、eIF4G的适体、柯萨奇病毒A(CVB1/2)或柯萨奇病毒B3(CVB3)。
10.如权利要求1-8任一所述的多聚核苷酸序列/载体，其特征在于，所述Intron为鱼腥藻属pre-tRNALeu基因内含子片段；所述E2为鱼腥藻属pre-tRNALeu基因内含子片段下游的Exon序列；所述E1为鱼腥藻属pre-tRNALeu基因内含子片段上游的Exon序列。
11.如权利要求10所述的多聚核苷酸序列/载体，其特征在于，所述E2为鱼腥藻属pre-tRNALeu基因内含子片段下游8-51个碱基大小的Exon序列；所述E1为鱼腥藻属pre-tRNALeu基因内含子片段上游2-15个碱基大小的Exon序列。
12.如权利要求11所述的载体，其特征在于，所述Intron序列如SEQ ID NO.1所示；所述E2序列如SEQ ID NO.2-9任一所示；所述E1序列如SEQ ID NO.12-19任一所示。
13.如权利要求1-8任一所述的多聚核苷酸序列/载体，其特征在于，所述Intron元件前还包括启动子元件，所述启动子元件启动多聚核苷酸序列/载体的体外转录。
14.如权利要求1-8任一所述的多聚核苷酸序列/载体在体外转录制备环状RNA中的应用。
15.一种环状RNA的制备方法，其特征在于，所述方法为：在启动子存在下，将权利要求5-8任一所述的多聚核苷酸序列/载体经过体外转录反应，即可生成环状RNA。
16.如权利要求7或8所述的多聚核苷酸序列/载体在制备蛋白质中的应用。
17.一种翻译产生蛋白质的方法，所述方法为：在启动子存在下，将权利要求7或8所述的多聚核苷酸序列/载体经体外转录形成环形RNA；将所述环形RNA转染至细胞翻译产生蛋白质。
...【技术特征摘要】
1.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
2.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
3.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
4.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
5.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
6.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
7.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
8.一种用于体外转录形成环状rna的多聚核苷酸序列/载体，所述多聚核苷酸序列/载体包含彼此可操作连接的并按以下顺序排列的元件：
9.如权利要求2-3或权利要求7-8任一所述的多聚核苷酸序列/载体，其特征在于，所述ires选自以下的ires序列：taura综合征病毒、吸血猎蝽病毒、泰累尔氏脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生症病毒、福曼脊髓灰质炎病毒1、大豆尺蠖病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、虱p病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、gb型肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71、马鼻病毒、茶尺蠖样病毒、脑心肌炎病毒(emcv)、果蝇c病毒、十字花科烟草病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑皇后细胞病毒、蚜虫致死麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜂麻痹病毒、芙蓉枯黄环斑病毒、猪瘟病毒、人类fgf2、人类sftpa1、人类amll/runxl、果蝇触角足、人类aqp4、人类at1r、人类bag-1、人类bcl2、人类bip、人类c-iapl、人类c-myc、人类eif4g、小鼠nds...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴东升，卫帅，
申请(专利权)人：优环苏州生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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