【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因检测，尤其是涉及一种基于taqman探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物及其应用。
技术介绍
1、食管癌是起源于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床常见的恶性肿瘤之一。食管癌的早期症状并不明显，且多为非持续性的，因而超过90％的食管癌患者在确诊时已进展至中晚期，患者预后差，生活质量低，总体的5年生存率不足20％。而早期食管癌(仅累及黏膜层和黏膜下浅层的病变)通常经内镜下微创治疗即可根治，患者5年生存率超过95％。因此，食管癌的早期发现、早期诊断和早期治疗是降低死亡率和提高生存率的主要策略。目前，食管内镜及病理活检是诊断食管癌的金标准。但是，由于内镜检查操作难度比较大，对医师的技术水平要求较高，且患者对内镜检查存在一定的畏惧心理，其依从性较差。因此，完善现有的筛查和诊断方法，是实现食管癌诊治的关键步骤。
2、食管癌的发生是由环境和遗传因素共同作用引起的。dna甲基化是人类基因组的主要表观遗传形式。在大多数类型的癌症中，dna甲基化通常存在异常。甲基化是基因组dna中胞嘧啶的共价修饰，主要发生在脊椎动物的cpg二核苷酸中，并且通常与长期转录抑制相关。申请人前期研究发现，食管鳞癌(escc)组织中sim1基因启动子甲基化水平明显高于癌旁正常组织，且它们的高甲基化和表达水平具有显著相关性，表明其高甲基化水平促进食管鳞癌的发展。因此，探索食管癌中基因的甲基化对于escc的早期诊断，精确预后和个体化治疗具有重要意义。
3、目前就甲基化检测而言，方法众多，大体可以分为两类：甲基化分型检测和甲基化图谱分析(m
4、针对现有技术中甲基化检测存在的问题，需要提供一种新的用于检测sim1基因启动子甲基化的方法，进而用于食管癌的诊断和辅助诊断。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本申请提供一种基于taqman探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物，利用该引物探针组合物或包括该引物探针组合物的试剂盒可对待测样本的sim1基因启动子中目标区域的dna甲基化水平进行检测，根据检测结果即可对待测样本是否患有食管癌进行诊断，检测方法简单、高效，可用于不同分期的食管癌患者，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性。
2、为此，本申请第一方面提供了一种基于taqman探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物，所述引物探针组合物用于检测sim1基因启动子中目标区域的甲基化水平；以grch38.p14为参考基因组，所述目标区域选自chr6:100465479-100465115区域及其互补序列，和chr6:100465479-100465115区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
3、本申请的专利技术人从ucsc及ensembl genomes数据库检索到sim1基因启动子的序列，通过对该启动子区域的dna序列进行分析，最终获得了sim1基因启动子中的目标区域。通过对目标区域设计基于taqman探针熔解曲线的pcr扩增引物以及检测探针，构建了sim1基因启动子甲基化检测的引物探针组合物，利用该引物探针组合物可用于食管癌患者的早期诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，且检测结果具有良好的灵敏度和特异性，对于食管癌早期诊断及改善患者预后具有重要意义。
4、在一些实施方式中，所述目标区域为如下所示的区域1和/或区域2；
5、所述区域1为chr6:100465479-100465286，其核苷酸序列如seq id no:1所示；
6、所述区域2为chr6:100465285-100465115，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
7、本申请的专利技术人通过进一步筛选优化最终将目标区域优化为区域1和/或区域2，通过对上述任一区域中的cpg二核苷酸位点是否发生甲基化进行检测，即可对待测样本作出精准判定。本申请中的上述区域1和区域2均为负链dna序列，且均属于chr6:100465479-100465115区域中的部分区域的互补序列。
8、在一些实施方式中，所述引物探针组合物包括用于检测所述区域1的引物探针组1和/或用于检测所述区域2的引物探针组2；所述引物探针组1和引物探针组2均包括一对上、下游引物和2条检测探针；其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如seq idno:3-4所示，2条检测探针的核苷酸序列分别如seq id no:5-6所示；引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:7-8所示，2条检测探针的核苷酸序列分别如seqid no:9-10所示；所述2条检测探针中一条为目标序列的甲基化检测探针，另外一条为目标序列的非甲基化检测探针。
9、本申请中，针对各目标区域的引物探针组中均包括2条检测探针，其中一条检测探针为目标序列的甲基化检测探针，另外一个检测探针为目标序列的非甲基化检测探针，这样可以根据目标序列甲基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物用于检测SIM1基因启动子中目标区域的甲基化水平；以GRCh38. p14为参考基因组，所述目标区域选自Chr6:100465479-100465115区域及其互补序列，和Chr6:100465479-100465115区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述目标区域为如下所示的区域1和/或区域2；
3. 根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括用于检测所述区域1的引物探针组1和/或用于检测所述区域2的引物探针组2；所述引物探针组1和引物探针组2均包括一对上、下游引物和2条检测探针；其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3-4所示，2条检测探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5-6所示；引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7-8所示，2条检测探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-10所示；所述2条检测
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括针对β-Actin内参基因的引物探针组，所述引物探针组中包括一对上、下游引物和1条检测探针；所述β-Actin内参基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述引物探针组中上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12-13所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
5.一种基于TaqMan探针熔解曲线法检测食管癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。
7.据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在使用时，PCR反应体系内每条上游引物的终浓度各自独立地为0.02~0.05μM，每条下游引物的终浓度各自独立地为0.2~0.5μM，每条检测探针的终浓度各自独立地为0.1~0.3μM。
8.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，利用所述试剂盒进行检测后，对检测结果的判读方式为：
9.一种如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物或者权利要求5-7中任意一项所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断待测样本是否为食管癌样本或食管癌的癌前病变样本的检测产品中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待测样本选自血液样本、组织样本和食管来源的细胞样本中的任意一种，所述食管癌为食管鳞癌。
...【技术特征摘要】
1.一种基于taqman探针熔解曲线法检测食管癌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物用于检测sim1基因启动子中目标区域的甲基化水平；以grch38. p14为参考基因组，所述目标区域选自chr6:100465479-100465115区域及其互补序列，和chr6:100465479-100465115区域中的部分区域及其互补序列中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述目标区域为如下所示的区域1和/或区域2；
3. 根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括用于检测所述区域1的引物探针组1和/或用于检测所述区域2的引物探针组2；所述引物探针组1和引物探针组2均包括一对上、下游引物和2条检测探针；其中引物探针组1中的上、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:3-4所示，2条检测探针的核苷酸序列分别如seq idno:5-6所示；引物探针组2中的上、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no:7-8所示，2条检测探针的核苷酸序列分别如seq id no:9-10所示；所述2条检测探针中一条为目标序列的甲基化检测探针，另外一条为目标序列的非甲基化检测探针。
4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括针对β-actin内参基因的引物探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑞瑞，刘世娇，刘瑞娜，朱怡倩，邱攀星，童京京，
申请(专利权)人：河南省华之源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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