同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法技术

本发明专利技术建立了１３种沙星类药物和３种氯霉素类药物的液质谱库和ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ检测方法，该前处理简单，重复性好，结合本发明专利技术建立的液质的谱库，能同时实现对１３种氟喹诺酮类药物类药物和３种氯霉素类药物的快速定量定性分析，分析时间缩短了一倍，非常适合进出口快速确证工作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及本专利技术属于食品安全领域，涉及一种同时检测食品中13种氟喹诺酮 类药物和3种氯霉素类药物的方法和建立13种氟喹诺酮类药物和3种氯霉素类药物的液 质谱库的方法。
技术介绍
氟喹诺酮(fluoroquinolones)是第三代喹诺酮类药物，该类药物对细菌的DNA螺 旋酶(DNA-gyrase)具有选择性抑制作用，从而抑制细菌的DNA合成，导致DNA降解及死亡。 该类药物抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，抗菌作用是磺胺类的近千倍，可与第三代 头孢类抗生素相媲美。对水产鱼类的消化道及鳃细菌性疾病也有良好的防治作用，自八十 年代起成为治疗鱼类疾病的主要抗菌药物，由于长期使用氟喹诺酮抗生素易导致动物群体 体内致病菌产生耐药性，某些氟喹诺酮类化合物还可能有潜在的致癌作用，该类药物在动 物性食品中的残留问题已经成为人们关注的焦点。我国以及世界卫生组织、欧盟、美国、日 本等国家和组织都将氟喹诺酮类药物列入限制使用的兽药药物名单中，并制订出相关的最 高残留限量MRL。随着国际间的技术壁垒的逐年增高，氟喹诺酮药物的残留限量迅速降低， 水产品行业的风险正日益增加。在我国，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氟哌酸、氧氟沙星 等氟喹诺酮类药物在蜂产品中的残留量不得超过10 μ g/kg;美国联邦法规关于鲶鱼中氟 喹诺酮的残留限量标准为5ppb，但阿拉巴马州和密西西比州作为美国鲶鱼加工的主要地 区，则规定鲶鱼中不得检出氟喹诺酮残留，即“零限量”标准。日本肯定列表规定，在蜂产品 中，恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星四种氟喹诺酮类药物的限量均为 2. 5μ g/kg ；欧盟规定，恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星四种氟喹诺酮类药物的限 量均为5μ g/kg ；美国和加拿大规定，氟喹诺酮类药物为养蜂业禁用药物，在蜂王浆中各种 氟喹诺酮类药物MRL为5μ g/kg。日本2006年5月29日开始实施“肯定列表制度”后，除有 暂定标准的物质如双氟沙星、恩诺沙星、噁喹酸等外，其余沙星类药物均按10 μ g/kg的“一 律标准”。06年广东省出口日本烤鳗恩诺沙星超标事件，07年美国、韩国对中国水产品氟喹 诺酮药物预警事件等都对我国水产品行业造成重大损失，水产品中氟喹诺酮药物的残留问 题已成为制约我国水产品生产和出口的一个重要因素。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是广谱抗生素，常用于预防与治疗动物疾病，在 水产品养殖业曾广泛使用。氯霉素存在毒副作用，能抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性 贫血、细胞减少性贫血、血小板减少和粒状白细胞减少。作为蛋白质合成抑制剂，会防碍红 细胞的产生[1]。氯霉素使用对人类健康潜在的危害已引起国际组织和世界上许多国家 和地区的高度重视。欧盟、美国等均在法规中规定CAP残留限量标准为“零容许量”(Zero tolerance)，即不得检出。甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)、氟甲砜霉素(Florfenicol，FF) 与氯霉素同属于一类化合物。人们已知甲砜霉素、氟甲砜霉素的毒性很低，甲砜霉素作为氯 霉素的可行替代品用于食用动物已获得公认。氟甲砜霉素是最新合成的此类化合物，在治疗那些已对其他抗菌素产生抗药性的传染病时，氟甲砜霉素可作为氯霉素和甲砜霉素的一 种替代品。甲砜霉素的最大残留限量MRL(maximumrequired limits)值为50 μ g/kg，氟甲 砜霉素的MRL值为100-3000 μ g/kg。氯霉素的最低要求执行限MRPL(minimum required performance limit)值为 0.3yg/kgo目前氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物残留的测定方法可以概括地划分为微生物 抑制法、免疫分析技术、色谱分析技术和液相色谱-质谱联用技术等。微生物抑制法是一种 价格低廉、操作简便的初筛方法。但这种方法在较低限量水平时不够灵敏，且由于具备抑菌 作用的抗生素种类繁多，干扰因素较多，假阳性较高。免疫分析技术灵敏度较高、快速简便， 但存在交叉反应及假阳性问题。色谱分析技术最常见的有采用荧光检测的高效液相色谱 法，近年来，随着液相色谱_质谱联用技术的发展，这种技术灵敏度高、定性准确，可实现多 种物质的同时定量与确证，越来越广泛地应用在了氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物残留的 分析中。但该两类化合物需要分别检测，且缺乏谱库检索，本专利技术选择13种常见的氟喹诺 酮类药物和3种氯霉素类药物为研究对象，建立该两类药物的LC-MS/MS (液相色谱-质谱 联用)谱库，并利用谱库检索建立水产品中同时检测13种常见的氟喹诺酮类药物和3种氯 霉素类药物的快速LC-MS/MS (液相色谱-串联质谱)筛选方法，这对保障我国水产品进出 口安全具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方 法，同时提供了建立氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的液质谱库的方法，其中氟喹诺酮类 药物为环丙沙星、单诺沙星、二氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、麻保沙星、萘啶酸、诺氟沙星、 氧氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹，氯霉素类药物为氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜 霉素。本专利技术检测方法检测13种氟喹诺酮类药物的检测限为0. 5ppb，3种氯霉素类药物的 检测限为0. Ippb，回收率大于80%。上述目的通过以下技术方案实现一种，其特征在于，所述 方法按如下步骤进行1)提取称取样品至离心管中，加入内标物溶液，再加入N，N-二甲基甲酰胺-乙 腈，经均质、水浴超声、12000r/min离心后，吸取上清液，在45 50°C氮气保护下浓缩，再加 入水，于涡旋振荡器振荡，得提取液；2)净化将所述提取液过HLB固相萃取小柱，先后以水、20%甲醇淋洗，弃去淋洗 液，抽干，用5%氨甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于瓶，50°C旋转蒸发至干，上述残渣加10%乙 腈溶解，于涡旋振荡器振荡，过滤膜，得净化液；3)将所述净化液进行液相色谱-串联质谱测定，液相色谱条件31) C18色谱柱，xdb-c8保护柱，柱温35°C，进样量10 μ L，流动相流速0. 3mL/min, 流动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；32)质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min ；气帘气氮气，流速20mL/min ；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700°C ；碰撞气氮气， 流速5mL/min ；电离电压5. 5kV ；监测方式多级反应监测；通过多级反应监测进行定量分 析；33)检测模式多级反应监测一自动信息关联扫描一增强离子扫描一谱库检索。一种建立氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的谱库的方法，其特征在于，所述方法 按如下步骤进行1)将氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物标准品进行液相色谱_串联质谱测定，液相色谱条件C18色谱柱，xdb-c8保护柱，柱温35°C，进样量10 μ L，流动相流速0. 3mL/min，流 动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min ； 气帘气氮气，流速20mL/min ；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700°C ；碰撞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：１）提取：称取样品至离心管中，加入内标物溶液，再加入Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺－乙腈，经均质、水浴超声、１２０００ｒ／ｍｉｎ离心后，吸取上清液，在４５～５０℃氮气保护下浓缩，再加入水，于涡旋振荡器振荡，得提取液；２）净化：将所述提取液过ＨＬＢ固相萃取小柱，先后以水、２０％甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，用５％氨甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于瓶，５０℃旋转蒸发至干，上述残渣加１０％乙腈溶解，于涡旋振荡器振荡，过滤膜，得净化液；３）将所述净化液进行液相色谱－串联质谱测定，３１）液相色谱条件：Ｃ１８色谱柱，ｘｄｂ－ｃ８保护柱，柱温３５℃，进样量１０μＬ，流动相流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ，流动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；３２）质谱条件：扫描方式：正负扫描方式，离子源：电喷雾离子源；雾化气：氮气，流速６５ｍＬ／ｍｉｎ；气帘气：氮气，流速２０ｍＬ／ｍｉｎ；辅助加热气：氮气，流速７０Ｌ／ｍｉｎ，温度７００℃；碰撞气：氮气，流速５ｍＬ／ｍｉｎ；电离电压：５．５ｋＶ；监测方式：多级反应监测；３３）检测模式：多级反应监测→自动信息关联扫描→增强离子扫描→谱库检索。...

【技术特征摘要】
一种同时检测食品中氟喹诺酮类药物和氯霉素类药物的方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行1)提取称取样品至离心管中，加入内标物溶液，再加入N，N 二甲基甲酰胺 乙腈，经均质、水浴超声、12000r/min离心后，吸取上清液，在45～50℃氮气保护下浓缩，再加入水，于涡旋振荡器振荡，得提取液；2)净化将所述提取液过HLB固相萃取小柱，先后以水、20％甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干，用5％氨甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于瓶，50℃旋转蒸发至干，上述残渣加10％乙腈溶解，于涡旋振荡器振荡，过滤膜，得净化液；3)将所述净化液进行液相色谱 串联质谱测定，31)液相色谱条件C18色谱柱，xdb c8保护柱，柱温35℃，进样量10μL，流动相流速0.3mL/min，流动相乙酸铵缓冲溶液和纯乙腈组成，采用线性梯度流动相洗脱；32)质谱条件扫描方式正负扫描方式，离子源电喷雾离子源；雾化气氮气，流速65mL/min；气帘气氮气，流速20mL/min；辅助加热气氮气，流速70L/min，温度700℃；碰撞气氮气，流速5mL/min；电离电压5.5kV；监测方式多级反应监测；33)检测模式多级反应监测→自动信息关联扫描→增强离子扫描→谱库检索。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1)中的内标物溶液具体为 100 μ g/L的同位素标记的氯霉素内标Chloramphen Icol-D5溶液和1000 μ g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯家望，蔡勤仁，周新朋，梁玉英，钱振杰，彭玉芬，蔡杰，薛良辰，
申请(专利权)人：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]