【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种合成人源乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母的构建方法与应用。
技术介绍
1、乳铁蛋白（lactoferrin, lf）是一种能结合铁的糖蛋白，分子量大小约为80 kda，转铁蛋白家族的成员之一。它的等电点（pi）为8.0-8.5。lf广泛存在于许多哺乳动物分泌物中，包括哺乳动物乳汁，唾液，眼泪，支气管和肠道分泌物以及中性粒细胞的次级颗粒。乳铁蛋白由两个由约700个氨基酸组成二硫键稳定的两个球形小叶组成，这两个球形小叶由一个α-螺旋连接，它们被称为氨基端区域和和羧基端区，在两个不同的温度下发生变性：约60℃和约90℃。乳铁蛋白的二级结构主要是α-螺旋和β-折叠交替排列，其高级结构是在二级结构的基础上，由多肽链折叠成而成。
2、lf具有广泛的生物学特性，包括抗菌，抗病毒，抗炎，抗氧化剂，抗癌，免疫调节和酶活性等，同时，lf在体内还发挥着转运铁离子的作用。它被称为天然抗生素，是连接哺乳动物先天和适应性免疫系统的重要成分，并在生命的各个阶段保护细胞方面发挥作用。因此，lf被认为是一种新的抗菌、抗癌的药物。目前，lf在许多商品中皆有添加，如婴幼儿配方奶粉、营养补充剂、牙膏等。由于乳铁蛋白具有抑菌，抗病毒，抗炎，促进铁离子吸收，抑制黑色素形成和促进胶原蛋白合成等诸多生物学功能，其作为化妆品新原料极具潜力。lf在现实生活中应用广泛，越来越多的研究者将目光转向这个功能性蛋白。
3、目前，获得乳铁蛋白的方式主要是从牛乳中分离提取，然而，牛乳仅含有0.03-0.49g/l乳铁蛋白。在提取的过程中不仅价
4、在过去的十几年中，研究者以酵母细胞作为宿主进行了人lf的异源表达。酵母表达系统虽然具有生长快，操作简单的特点，还具各翻译后加工和修饰功能，但其系统固有的一些缺陷比如人源性蛋白分子、细胞因子不能在酵母中高效表达，并且蛋白产物容易形成多聚体进而导致蛋白降解。
5、研究者主要通过优化酵母表达系统中的关键表达元件（启动子、终止子、增强子以及沉默子），增强外源蛋白的表达水平。但是当外源蛋白在细胞内大量积累时，对细胞分泌系统造成很大的压力，易引起细胞的崩溃，导致外源蛋白的降解，减少蛋白的产量。为了增强外源基因的表达水平，必须解决外源蛋白顺利分泌的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，促进乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中正确折叠，并能够快速的分泌到细胞外，实现增强乳铁蛋白的高效表达，本专利技术分别在细胞内使用马克斯克鲁维酵母原有启动子gap3增加emp47和vip36的表达，并验证了emp47和vip36对乳铁蛋白表达量的影响，通过摇瓶发酵菌株，获取上清中的蛋白进行验证发现，emp47和vip36对乳铁蛋白的表达量具有促进作用，实验获得一株乳铁蛋白高效合成的马克斯克鲁维酵母菌株。本专利技术不仅实现提高乳铁蛋白表达量的目的，同时也提供了一种增加乳铁蛋白分泌表达水平的方法。
2、第一方面，本专利技术要求保护一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法。
3、本专利技术要求保护的构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，可包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子增加emp47蛋白和vip36蛋白的表达，从而获得用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。
4、该方法中，通过增加所述emp47蛋白和所述vip36蛋白的表达，实现促进所述人乳铁蛋白在马克斯克鲁维酵母中分泌表达。
5、其中，所述emp47蛋白和所述vip36蛋白在内质网表达。所述emp47蛋白和所述vip36蛋白可来自于里氏木霉qm6a；进一步地，所述emp47蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。所述vip36蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。
6、进一步地，在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白可通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现。
7、进一步地，采用所述马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子增加所述emp47蛋白和所述vip36蛋白的表达可通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入能够表达所述emp47蛋白和所述vip36蛋白的基因表达框实现。在所述基因表达框中，由所述马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子启动所述emp47蛋白的编码基因和所述vip36蛋白的编码基因的表达。具体地，在所述基因表达框中，自5’端到3’端依次包含所述马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子、所述emp47蛋白的编码基因、所述马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子、所述vip36蛋白的编码基因。
8、更进一步地，所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。
9、更进一步地，在所述基因表达框中，所述马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述emp47蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述vip36蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
10、在本专利技术的具体实施方式中，所述基因表达框插入并替换了所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的 och1基因。敲除 och1基因是为了阻断酵母的高甘露糖基化修饰，为后续的糖基化修饰做准备。真核生物在内质网中的n糖基化修饰都是高度保守的，不同点在于转运到高尔基体后，酵母通过 och1基因在α-1,3-甘露糖上添加了一个α-1,6-甘露糖，然后其他的甘露糖转移酶和磷酸甘露糖转移酶以此糖链结构为基础向上继续添加甘露糖，最终形成高甘露糖型结构。
11、具体地，所述基因表达框插入并替换所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的 och1基因是通过同源重组实现的。进行所述同源重组的上游同源臂的序列如seq id no.8所示，下游同源臂的序列如seq id no.9所示。
12、在本专利技术的具体实施方式中，所述马克斯克鲁维酵母受体菌为马克斯克鲁维酵母 km::△ ura3；所述马克斯克鲁维酵母 km::△ ura3为将马克斯克鲁维酵母fim本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母来源的GAP3启动子增加EmP47蛋白和Vip36蛋白的表达，从而获得用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述EmP47蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白是通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现的；
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述基因表达框中，所述马克斯克鲁维酵母来源的GAP3启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述EmP47蛋白的编码基因的核苷酸
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述基因表达框插入并替换了所述马克斯克鲁维酵母受体菌的基因组中的Och1基因。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母受体菌为马克斯克鲁维酵母KM::△ura3；所述马克斯克鲁维酵母KM::△ura3为将马克斯克鲁维酵母FIM1基因组中的Ura3基因敲除后所得菌株。
9.一种用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株，其特征在于：所述马克斯克鲁维酵母工程菌株是采用权利要求1-8中任一所述方法构建得到的。
10.权利要求9所述的马克斯克鲁维酵母工程菌株在发酵生产人乳铁蛋白中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种构建用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株的方法，包括如下步骤：在马克斯克鲁维酵母受体菌中表达人乳铁蛋白的同时，采用马克斯克鲁维酵母来源的gap3启动子增加emp47蛋白和vip36蛋白的表达，从而获得用于发酵生产人乳铁蛋白的马克斯克鲁维酵母工程菌株。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述emp47蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示；
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的氨基酸序列如seq idno.6所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述马克斯克鲁维酵母受体菌中表达所述人乳铁蛋白是通过向所述马克斯克鲁维酵母受体菌中导入所述人乳铁蛋白的编码基因实现的；
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述人乳铁蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：在...
【专利技术属性】
技术研发人员：田愉，金城，葛亚平，
申请(专利权)人：北京国科星联科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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