【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及乳制品检测，尤其涉及一种基于双管双重pcr鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合及其应用。
技术介绍
1、目前市售乳及乳制品多种多样，特色乳品因其丰富的营养价值更受市场广泛关注。当前市售乳品除常见的牛乳外，还有水牛乳、牦牛乳、驼乳、山羊乳、绵羊乳、马乳和驴乳7种动物源性乳品。近年来，商品化的水牛乳、羊乳、驼乳、马乳和驴乳等特色乳产品进入大众消费市场，已有研究表明多种特色乳营养价值高于牛乳，是特需人群重要营养来源且对某些疾病的辅助治疗具有独特的效果。但另一方面，由于这些乳品因产量低、价格高，市场上频频出现不法商家为谋取利益，将乳品以次充好或使用假冒伪劣乳品进行售卖的现象。这种行为不仅侵害了消费者权益，且标签不明或故意隐藏成分导致人体过敏反应和饮食文化的不利影响，影响了乳品产业的健康发展。
2、如今，已有多种检测技术和标准用于乳品掺伪的源性鉴定。基于蛋白质或脂肪的理化鉴定方法，如色谱、质谱、光谱和等电聚焦等技术，由于市售乳及乳制品多经过高温高压等加工过程造成部分蛋白质、脂肪变性，检测特异性差而导致检测结果呈假阴性，且所需设备昂贵。相比之下，基于物种特异性dna的分析技术在物种鉴定中更具优势。乳中含有乳腺体细胞，是dna分子的主要来源，可以用于乳源鉴定，且dna分子相对于蛋白质更稳定，特异性更高。因此，基于dna分子的检测技术在乳及乳制品源性检测领域得到广泛应用。其中，基于pcr及其衍生技术开发的检测方法应用最为广泛，此类技术仅需少量dna分子，便可获得足够分析的基因组信息，准确鉴定到物种，灵敏度高，特异
3、因此，基于市售乳品掺伪现状和其源性成分鉴定需求，建立一种可同时检测市售乳品成分来源的检测方法，为市场监管和乳品鉴定提供技术支持，对提高市场监管能力和维护消费者权益都具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于双管双重pcr鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合及其应用。本专利技术使用1对通用引物和2对特异性引物，以及多个物种特异性探针，组合成双管双重pcr体系，实现了2管pcr反应对8个物种的高通量检测，降低了多重pcr体系引物间的交叉反应和优化难度，提高了检测效率。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种用于鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合，所述引物和探针组合包括内参上游引物16s1f、内参下游引物16s1r、马源上游引物hf1、马源下游引物hr1、驴源上游引物df1、驴源下游引物dr1、通用上游引物a2-f、通用下游引物b4-r、内参探针16sp2、水牛特异性探针bp4、山羊特异性探针gp1、绵羊特异性探针sp、马特异性探针hp1-1、骆驼特异性探针cp2、牦牛特异性探针yp1、驴特异性探针dp1s、奶牛特异性探针tp2；
4、所述内参上游引物16s1f的核苷酸序列如seq id no.1所示；
5、所述内参下游引物16s1r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、所述马源上游引物hf1的核苷酸序列如seq id no.3所示；
7、所述马源下游引物hr1的核苷酸序列如seq id no.4所示；
8、所述驴源上游引物df1的核苷酸序列如seq id no.5所示；
9、所述驴源下游引物dr1的核苷酸序列如seq id no.6所示；
10、所述通用上游引物a2-f的核苷酸序列如seq id no.7所示；
11、所述通用下游引物b4-r的核苷酸序列如seq id no.8所示；
12、所述内参探针16sp2的核苷酸序列如seq id no.9所示；
13、所述水牛特异性探针bp4的核苷酸序列如seq id no.10所示；
14、所述山羊特异性探针gp1的核苷酸序列如seq id no.11所示；
15、所述绵羊特异性探针sp的核苷酸序列如seq id no.12所示；
16、所述马特异性探针hp1-1的核苷酸序列如seq id no.13所示；
17、所述骆驼特异性探针cp2的核苷酸序列如seq id no.14所示；
18、所述牦牛特异性探针yp1的核苷酸序列如seq id no.15所示；
19、所述驴特异性探针dp1s的核苷酸序列如seq id no.16所示；
20、所述奶牛特异性探针tp2的核苷酸序列如seq id no.17所示。
21、优选的，所述内参探针16sp2、水牛特异性探针bp4和骆驼特异性探针cp2序列的5'端修饰有报告基团fam，3'端修饰有淬灭基团bhq1；山羊特异性探针gp1和牦牛特异性探针yp1序列的5'端修饰有报告基团vic，3'端修饰有淬灭基团bhq1；绵羊特异性探针sp和驴特异性探针dp1s序列的5'端修饰有报告基团rox，3'端修饰有淬灭基团bhq2；马特异性探针hp1-1和牛特异性探针tp2序列的5'端修饰有报告基团cy5，3'端修饰有淬灭基团bhq3。
22、本专利技术还提供了一种上述引物和探针组合在制备基于双管双重pcr鉴定8种动物源性乳及乳制品试剂或试剂盒中的应用，所述动物源性乳及乳制品来自奶牛、水牛、牦牛、骆驼、山羊、绵羊、马和驴。
23、本专利技术还提供了一种基于双管双重pcr鉴定8种动物源性乳及乳制品的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针组合。
24、本专利技术还提供了一种利用上述试剂盒鉴定8种动物源性乳及乳制品的方法，包括如下步骤：
25、(1)提取待测样品的dna；
26、(2)采用上述引物和探针组合配制荧光pcr反应体系，并设置阳性对照和空白对照，对所述待测样品的dna进行荧光pcr扩增；
27、(3)根据荧光pcr扩增结果，进行结果判定；
28、所述荧光pcr反应体系包括管1体系、管2体系、内参体系；所述阳性对照包括管1阳性对照和管2阳性对照；
29、所述管1阳性对照以水牛、山羊、绵羊和马的混合dna为模板进行扩增，所述管2阳性对照以骆驼、牦牛、驴和奶牛的混合dna为模板进行扩增；
30、所述空白对照为ddh2o。
31、优选的，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合包括内参上游引物16S1F、内参下游引物16S1R、马源上游引物HF1、马源下游引物HR1、驴源上游引物DF1、驴源下游引物DR1、通用上游引物A2-F、通用下游引物B4-R、内参探针16SP2、水牛特异性探针BP4、山羊特异性探针GP1、绵羊特异性探针SP、马特异性探针HP1-1、骆驼特异性探针CP2、牦牛特异性探针YP1、驴特异性探针DP1S、奶牛特异性探针TP2；
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述内参探针16SP2、水牛特异性探针BP4和骆驼特异性探针CP2序列的5'端修饰有报告基团FAM，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；山羊特异性探针GP1和牦牛特异性探针YP1序列的5'端修饰有报告基团VIC，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；绵羊特异性探针SP和驴特异性探针DP1S序列的5'端修饰有报告基团ROX，3'端修饰有淬灭基团BHQ2；马特异性探针HP1-1和牛特异性探针TP2序列的5'端修饰有报告基团CY5，3'端修饰有淬灭基团BHQ3。
3.一种权
4.一种基于双管双重PCR鉴定8种动物源性乳及乳制品的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物和探针组合。
5.一种利用权利要求4所述试剂盒鉴定8种动物源性乳及乳制品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述管1体系为2×Premix Ex Taq(ProbeqPCR)12.5μL，上、下游引物mix各0.5μL，探针mix 1.0μL，待测样品的DNA2.0μL，ddH2O补至25.0μL；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述管2体系为2×Premix Ex Taq(ProbeqPCR)12.5μL，上、下游引物mix各0.5μL，探针mix 1.0μL，待测样品的DNA2.0μL，ddH2O补至25.0μL；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内参体系为2×Premix Ex Taq(ProbeqPCR)12.5μL，内参上游引物16S1F、内参下游引物16S1R各0.5μL，内参探针16SP21.0μL，待测样品的DNA 2.0μL，ddH2O补至25.0μL；上游引物、下游引物的终浓度为150～250nM，探针的终浓度为350～500nM；所述待测样品的DNA的终浓度为0.4～2.0ng/μL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR的扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，40个循环。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述结果判定的标准为：当内参和阳性对照Ct≤35，空白对照Ct为0时可以进行相应源性结果判定；当相应探针Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应多源性。
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定8种动物源性乳及乳制品的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合包括内参上游引物16s1f、内参下游引物16s1r、马源上游引物hf1、马源下游引物hr1、驴源上游引物df1、驴源下游引物dr1、通用上游引物a2-f、通用下游引物b4-r、内参探针16sp2、水牛特异性探针bp4、山羊特异性探针gp1、绵羊特异性探针sp、马特异性探针hp1-1、骆驼特异性探针cp2、牦牛特异性探针yp1、驴特异性探针dp1s、奶牛特异性探针tp2；
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述内参探针16sp2、水牛特异性探针bp4和骆驼特异性探针cp2序列的5'端修饰有报告基团fam，3'端修饰有淬灭基团bhq1；山羊特异性探针gp1和牦牛特异性探针yp1序列的5'端修饰有报告基团vic，3'端修饰有淬灭基团bhq1；绵羊特异性探针sp和驴特异性探针dp1s序列的5'端修饰有报告基团rox，3'端修饰有淬灭基团bhq2；马特异性探针hp1-1和牛特异性探针tp2序列的5'端修饰有报告基团cy5，3'端修饰有淬灭基团bhq3。
3.一种权利要求1或2所述引物和探针组合在制备基于双管双重pcr鉴定8种动物源性乳及乳制品试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述动物源性乳及乳制品来自奶牛、水牛、牦牛、骆驼、山羊、绵羊、马和驴。
4.一种基于双管双重pcr鉴定8种动物源性乳及乳制品的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物和探针组合。
5.一种利用权利要求4所述试剂盒鉴定8种动...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏慧丽，马新宇，黄雅芳，潘映秋，管峰，
申请(专利权)人：台州市食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：
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