【技术实现步骤摘要】
本申请涉及植物干细胞培养的，更具体地说，它涉及一种茶树茎尖干细胞的培养方法。
技术介绍
1、茶作为一种中国传统饮料，每年的市场需求是巨大的。另外，茶中还含有较多的高价值物质，例如茶多酚等。目前茶叶培养方式包括传统种植培养和植物组织培养。其中传统的种植培养一直以来存在土地占用率高、病虫害问题严重以及培养周期长的问题。而植物组织培养技术的兴起在一定程度上解决了传统培养的土地占用率高、病虫害以及培养周期长的问题。
2、其中植物组织培养的方法中常用的是愈伤组织培养法，该方法能够在短时间内获得茶苗。但茶树的愈伤组织细胞中液泡占比高，该类细胞对振荡培养的剪切力敏感，且经多次有丝分裂后，容易产生dna甲基化以及转座子激活等变异现象，导致培养过程不稳定，天然产物的产量、性质不稳定等缺点。
3、基于以上问题，植物干细胞培养技术逐渐兴起。干细胞是“具有自我更新复制能力和分化潜能的细胞”，而植物干细胞实为传统植物解剖学范畴中的分生组织，包括茎尖分生组织(shoot apical meristem)、根尖分生组织(root apical meristem)、侧生分生组织以及部分髓射线细胞，其具有产生所有分化细胞类型的能力以及旺盛的分裂能力和较高的遗传稳定性。
4、植物干细胞具有多个小液泡、线粒体活性高、聚集度低、细胞壁无木质素沉积等特点，低温保藏后仍维持较高的细胞活性，在悬浮培养过程中大部分以单细胞形式存在，对剪切力不敏感，能维持稳定的增殖速度，可以长期稳定培养。
5、目前研究成熟的植物干细胞培养技术仅见
6、茶叶中的茶多酚含量是很高的，一般为茶叶质量的15-30wt％，是茶叶中的主要有效物质。茶多酚中的儿茶素是茶多酚中的主要物质，一般占茶多酚类物质的60-80wt％；儿茶素类物质具抗氧化、抗肿瘤、降低血液中胆固醇及低密度酯蛋白含量、抑制血压上升、抑制血小板凝集、抗菌、抗产物过敏等功效。
7、若是能通过茶树茎尖干细胞的培养，获得儿茶素类物质含量高的干细胞，其将具有巨大的市场前景。
技术实现思路
1、为了提供一种性能稳定的茶树干细胞培养技术，并得到儿茶素含量高的茎尖干细胞，本申请提供一种茶树茎尖干细胞的培养方法。
2、本申请提供的一种茶树茎尖干细胞的培养方法采用如下的技术方案：
3、一种茶树茎尖干细胞的培养方法，包括以下步骤：
4、步骤一、取茶树茎尖，清洗消毒后，取茎尖的分生组织置于干细胞诱导培养基上，在22-28℃下培养14-18天，得到茎尖干细胞团；
5、步骤二、将所述茎尖干细胞团以含有果胶酶和纤维素酶的酶溶液酶解处理以去除细胞壁，分离得到茎尖干细胞；
6、步骤三、将所述茎尖干细胞置于干细胞培养液上震荡培养6-8天，更换干细胞培养液后继续培养6-8天，去除细胞团和大颗粒残渣；将细胞培养液进一步置于干细胞培养液内扩大培养，即得；
7、步骤一中所述干细胞诱导培养基的组分包括：
8、ms培养基，萘乙酸0.4-0.8mg/ml，6-苄氨基腺嘌呤0.4-0.8mg/ml，吲哚乙酸0.1-0.3mg/ml，醋酸棉酚0.1-0.5mg/ml。
9、相关研究表明：在组织培养方面，棉酚和吲哚丁酸协作下可以促进不定根诱导，棉酚和激动素协作可抑制愈伤组织产生；在植物育种方面，棉酚能够调控果树和烟草腋芽的发育，降低植物种子的萌发率，抑制植物幼苗生长，以及降低植物过氧化物酶活性等。但是关于醋酸棉酚在植物组织培养和植物育种方面，并没有相关的研究。本申请通过在干细胞诱导培养基内添加醋酸棉酚，以得到茶多酚含量高的茶树茎尖干细胞。其原因可能在于：醋酸棉酚是一种易溶于水的物质，醋酸棉酚含有多羟基和羧基，因此能够提供一种酸性环境，为干细胞诱导提供一个刺激性的外源环境；该外源环境刺激下使得干细胞代谢过程被影响，尤其是对茶多酚代谢途径的液相；在醋酸棉酚和其余激素，尤其是和吲哚乙酸的协作下，发挥诱导干细胞的作用，并提高干细胞内茶多酚含量。
10、可选的，步骤一中所述干细胞诱导培养基的组分包括：
11、ms培养基，萘乙酸0.65mg/ml，6-苄氨基腺嘌呤0.6mg/ml，吲哚乙酸0.15mg/ml，醋酸棉酚0.25mg/ml。
12、可选的，步骤三中的所述干细胞培养液的组分包括：ms培养基，吲哚乙酸0.2-0.6mg/ml，醋酸棉酚0.2-0.6mg/ml。
13、通过采用上述技术方案，进一步在干细胞培养时持续提供刺激性的外源环境，以获得干细胞内茶多酚含量的干细胞。
14、可选的，步骤三中的所述干细胞培养液的组分包括：ms培养基，吲哚乙酸0.4mg/ml，醋酸棉酚0.4mg/ml。
15、可选的，步骤三中进行干细胞培养液培养时，以100-150rpm的转速震荡；培养温度为22-24℃。
16、通过采用上述技术方案，以通过转动产生的震荡进一步提高物料交换速率并保证培养液均匀，以提高细胞生长和代谢速率。
17、可选的，步骤三中的扩大培养具体包括以下步骤：将细胞培养液在新的干细胞培养液内培养6-8天后，更换干细胞培养液，继续培养18-25天。
18、通过采用上述技术方案，以得到足够数量的茎尖干细胞。
19、可选的，步骤三中以筛网去除细胞团和大颗粒残渣；所述筛网为100-200目筛网。
20、通过采用上述技术方案，以去除其中未分散的细胞团、杂质物质等。
21、可选的，步骤二中所述酶溶液中纤维素酶的质量分数为0.1-0.5wt％，果胶酶的质量分数为0.1-0.4wt％；酶解时间为7-10h。
22、可选的，步骤一中清洗消毒茶树茎尖具体包括以下步骤：
23、清洗：将茶树茎尖以水清洗，以洗衣粉液清洗；
24、消毒：以乙醇溶液消毒，以双氧水溶液消毒，以无菌水冲洗。
25、可选的，消毒时，乙醇溶液消毒时间为20-40s，乙醇溶液中乙醇含量为70-80vol.％；双氧水溶液消毒时间为30-40min，双氧水溶液双氧水含量为45-55wt％。
26、综上所述，本申请具有以下有益效果：
27、1、以本申请的方法成功制备了茶树茎尖干细胞，为短期获得茶树茎尖细胞提供一种新的思路；此外本申请的茎尖干细胞中含有较高量的儿茶素类，该茎尖干细胞可用于儿茶素类快速高产的生产。
28、2、本申请中通过在干细胞诱导培养基和干细胞培养液内添加醋酸棉酚，以达到显著提高茎尖干细胞内儿茶素类含量的目的。
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1.一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤一中所述干细胞诱导培养基的组分包括：
3.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中的所述干细胞培养液的组分包括：MS培养基，吲哚乙酸0.2-0.6mg/mL，醋酸棉酚0.2-0.6mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中的所述干细胞培养液的组分包括：MS培养基，吲哚乙酸0.4mg/mL，醋酸棉酚0.4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中进行干细胞培养液培养时，以100-150rpm的转速震荡；培养温度为22-24℃。
6.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中的扩大培养具体包括以下步骤：将细胞培养液在新的干细胞培养液内培养6-8天后，更换干细胞培养液，继续培养18-25天。
7.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培
8.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤二中所述酶溶液中纤维素酶的质量分数为0.1-0.5wt%，果胶酶的质量分数为0.1-0.4wt%；酶解时间为7-10h。
9.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤一中清洗消毒茶树茎尖具体包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，消毒时，乙醇溶液消毒时间为20-40s，乙醇溶液中乙醇含量为70-80Vol.%；双氧水溶液消毒时间为30-40min，双氧水溶液双氧水含量为45-55wt%。
...【技术特征摘要】
1.一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤一中所述干细胞诱导培养基的组分包括：
3.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中的所述干细胞培养液的组分包括：ms培养基，吲哚乙酸0.2-0.6mg/ml，醋酸棉酚0.2-0.6mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中的所述干细胞培养液的组分包括：ms培养基，吲哚乙酸0.4mg/ml，醋酸棉酚0.4mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中进行干细胞培养液培养时，以100-150rpm的转速震荡；培养温度为22-24℃。
6.根据权利要求1所述的一种茶树茎尖干细胞的培养方法，其特征在于，步骤三中的扩大培...
【专利技术属性】
技术研发人员：方晓霞，赵永军，赵一鸣，周江珊，
申请(专利权)人：浙江觅得优生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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