【技术实现步骤摘要】
本申请涉及疾病检测，更具体地说，它涉及一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、棘球蚴病(echinococcosis)又称包虫病(hydatidosis)。该病不仅是传播最广泛的寄生虫病之一，也是公共卫生方面治疗和预防费用最高的疾病之一，呈地方性流行，是由棘球属的绦虫的幼虫寄生于人或动物机体组织所引发的传染病。采取早期诊断、早期治疗以及积极防治动物传染源的综合性防治措施，对控制包虫病对人类健康和畜牧业发展的影响十分重要。
2、包虫病的诊断目前主要依靠于b超、影像学检查和病理学检查等。因方法自身限制，易造成小病灶、非典型病灶的误诊和漏诊。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的包虫检测方法。随着分子生物学技术的发展，近年来出现了一系列检测包虫病的新方法，如多重pcr检测法、粪抗原elisa法、粪dna检测方法等。elisa方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低。
3、目前在包虫病检测方面已开发了多种pcr检测方法，trachsel,d.等开发了一种多重pcr来区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和带绦虫的感染；shang等开发了多重pcr检测方法，用于3种棘球绦虫的特异性和敏感性检测。“液体活检”作为体外诊断的一个分支，是指一种非侵入式的体液测试。目前针对于血液、尿液、唾液等样本的细胞外游离dna的检测已经在疾病监控、胎儿产前检测及肿瘤靶向药物指导等相关领域应用。但循环游离dna的检测能否用于包虫病分型诊断仍是一个问题，2018年法国科学家检测
技术实现思路
1、本申请中u1snrna基因在genbank数据库中的基因编号为m73768.1；cytb基因在genbank数据库中的基因编号为ab461399.1。
2、为了提高检测结果的敏感度、准确度，降低成本，本申请提供一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒及其检测方法
3、本申请提供的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒及其检测方法采用如下的技术方案：
4、第一方面，本申请提供一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，采用如下的技术方案：
5、一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，包括用于检测多房棘球绦虫dna的两组u1snrna基因和cytb基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
6、u1snrna基因上游引物u1snrna-f：5′-accacgtgagacagattgcat-3′，
7、u1snrna基因下游引物u1snrna-r：5′-cgaaatggccagaggtgaga-3′，
8、u1snrna基因探针u1snrna-p：5′-vic-ctgcagtgaaccacacagttgc-bhq1-3′；
9、cytb基因上游引物cytb-f：5′-accttggcgtcagatgtc-3′，
10、cytb基因下游引物cytb-r：5′-ccaaccaacggcaaactatc-3′，
11、cytb基因探针cytb-p：5′-fam-tgggctgccactgtccttacttca-bhq1-3′；
12、人内源基因上游引物rpolya-f：5′-tgaagccgtgcggaagg-3′，
13、人内源基因下游引物rpolya-r：5′-acaagagagccaagtgtcg-3′，
14、人内源基因探针rpolya-p1：
15、5′-fam-taccacgtcatctcctttgatggctcctat-bhq1-3′，
16、人内源基因探针rpolya-p2：
17、5′-vic-taccacgtcatctcctttgatggctcctat-bhq1-3′。
18、优选的，所述探针u1snrna-p序列的5′标记为vic报告荧光基团，3′端标记物为bhq1淬灭荧光基团；所述探针cytb序列的5′标记为fam报告荧光基团，3′端标记物为bhq1淬灭荧光基团。
19、优选的，所述探针rpolya-p1序列的5′标记为fam报告荧光基团，3′端标记物为bhq1淬灭荧光基团；所述探针rpolya-p2序列的5′标记为vic报告荧光基团，3′端标记物为bhq1淬灭荧光基团。
20、优选的，所述试剂盒还包括taq酶、dntps、mg2+、pcr反应缓冲体系中的一种或多种。
21、优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
22、优选的，所述试剂盒中引物终浓度为800nm，探针终浓度为100nm-400nm。
23、第二方面，本申请提供一种血浆中多房棘球绦虫游离dna的检测方法，采用如下的技术方案：
24、一种血浆中多房棘球绦虫游离dna的检测方法，包括以下步骤：
25、s1、提取血浆样本中的总游离dna；
26、s2、以步骤s1中的总游离dna为模板，使用预混pcr体系制备pcr扩增体系；
27、s3、使用液滴生成仪制备油包水微滴体系；
28、s4、微滴体系进行pcr扩增；
29、s5、使用液滴检测仪检测pcr扩增后液滴fam通道和vic通道的荧光强度，并使用机器自带软件进行数据分析，识别cytb基因、u1snrna基因和人内源基因阳性的液滴。
30、优选的，步骤s2中制备pcr扩增体系时反应引物终浓度为800nm，cytb基因探针终浓度为333nm，u1snrna基因探针终浓度为200nm，人内源基因探针1和人内源基因探针2终浓度均为100nm，预混液体积20μl，模板dna体积10μl。
31、优选的，步骤s4中进行pcr扩增时以u1snrna-f、u1snrna-r、cytb-f、cytb-r引物对为引物，以rpolya-f、rpolya-r对为质控引物，以u1snrna-p、cytb-p、rpolya-p1、rpolya-p2为探针进行pcr扩增反应，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火、延伸1min，共50个循环。
32、综上所述，本申请具有以下有益效果：
33、1、准确度高，本专利技术根据多房棘球绦虫病原体dna特异位点设计引物和探针，能够准确检测血浆中多房棘球绦虫游离dna。
34、2、操作简便，本专利技术将区分多房棘球蚴人源基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括用于检测多房棘球绦虫DNA的两组U1snRNA基因和CYTB基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述探针U1snRNA-P序列的5´标记为VIC报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针CYTB-P序列的5´标记为FAM报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述探针RpolyA-P1序列的5´标记为FAM报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针RpolyA-P2序列的5´标记为VIC报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲体系中的一种或多种。
5.根据
6.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物终浓度为800nM，探针终浓度为100nM-400nM。
7.一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，其特征在于，步骤S2中制备PCR扩增体系时反应引物终浓度为800nM，CYTB基因探针终浓度为333nM，U1snRNA基因探针终浓度为200nM，人内源基因探针1和人内源基因探针2终浓度均为100nM，预混液体积20μL，模板DNA体积10μL。
9.根据权利要求7所述的一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，其特征在于，步骤S4中进行PCR扩增时以U1snRNA-F、U1snRNA-R、CYTB-F、CYTB-R引物对为引物，以RpolyA-F、RpolyA-R对为质控引物，以U1snRNA-P、CYTB-P、RpolyA-P1、RpolyA-P2为探针进行PCR扩增反应，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火、延伸1min，共50个循环。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，其特征在于，包括用于检测多房棘球绦虫dna的两组u1snrna基因和cytb基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，其特征在于，所述探针u1snrna-p序列的5´标记为vic报告荧光基团，3´端标记物为bhq1淬灭荧光基团；所述探针cytb-p序列的5´标记为fam报告荧光基团，3´端标记物为bhq1淬灭荧光基团。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，其特征在于，所述探针rpolya-p1序列的5´标记为fam报告荧光基团，3´端标记物为bhq1淬灭荧光基团；所述探针rpolya-p2序列的5´标记为vic报告荧光基团，3´端标记物为bhq1淬灭荧光基团。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括taq酶、dntps、mg2+、pcr反应缓冲体系中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：马艳艳，江源，孙莉，张灵强，张耀刚，张涛，杨紫晗，侯静，
申请(专利权)人：青海大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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