【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荷花nnap2基因及编码蛋白、引物、载体构建及应用，应用在调控荷花重瓣花领域。
技术介绍
1、本章节中的说明只提供涉及本公开的背景信息而不构成现有技术。
2、荷花又名莲，是山龙眼目莲科莲属水生植物。莲属主要有两个种，分别为亚洲莲(nelumbo nucifera gaertn.)和美洲黄莲(nelumbo luteapers.)，两者在形态上存在差异，但具有相同的染色体数(2n＝16)，且可以相互杂交可育。经过长期的栽培驯化和人工选择，形成了单瓣荷花和重瓣(包括重台和千瓣)荷花。荷花的不同类型重瓣花是雄蕊、雌蕊、花瓣及花萼(即萼片)不同程度瓣化的结果。重瓣莲拥有瓣化雄蕊和/或瓣化雌蕊，极具观赏性。
3、ap2(apetela2)是一个重要的同源异型基因，决定花的分生组织和花发育。拟南芥中过表达35s::ap2ml植株出现了很多的花瓣和一些花器官丢失。同样，月季中过表达rcap2会使雄蕊转化成花瓣，导致花瓣数目增多；而沉默rcap2则使花瓣数目减少。拟南a类基因芥的ap2和c类基因ag相互拮抗。拟南芥ag突变体产生重瓣花。然而，与拟南芥不同，牵牛花和金鱼草的ap2类似基因不依赖抑制c类基因途径调控花重瓣。而目前，有关荷花ap2同源基因调控重瓣花形成的研究尚未报道。
4、因此提供一种能用于调控重瓣花、能使拟南芥花萼和花瓣的数目增多并能恢复拟南芥突变体的花瓣器官的荷花nnap2基因及编码蛋白、引物、载体构建及应用己成为当务之亟。
技术实现思路p>
1、为了克服现有技术中没有荷花ap2同源基因调控重瓣花的研究和应用的缺点，本专利技术提供一种荷花nnap2基因及编码蛋白、引物、载体构建及应用，通过导入荷花nnap2基因可用于调控重瓣花，实现拟南芥花萼和花瓣的数目增多以及拟南芥突变体花瓣器官的恢复。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种荷花nnap2基因，包括的序列如seq id no:1所示。
4、荷花nnap2基因可用于调控重瓣花，实现拟南芥花萼和花瓣的数目增多以及拟南芥突变体花瓣器官的恢复。
5、所述荷花nnap2基因的编码蛋白的序列如seq id no:2所示。
6、所述荷花nnap2基因的克隆引物包括nnap2-cds-f和nnap2-cds-r，nnap2-cds-f和nnap2-cds-r的序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。
7、通过特别设计的克隆引物可克隆出荷花nnap2基因片段(电泳图如图1所示)。
8、所述荷花nnap2基因的验证引物包括nnap2-q-f和nnap2-q-r，nnap2-q-f和nnap2-q-r的序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示。
9、选用荷花品种粉红凌霄作为表达谱分析材料。具体操作步骤如下：
10、采集盛花期的荷花各组织，包括叶片、花芽、花瓣、瓣化雄蕊、雄蕊、心皮、莲蓬，将上述组织样品迅速进行液氮速冻并保存在-80℃超低温冰箱中。提取各组织样品的总rna，反转录合成cdna。以上述反转录合成的cdna为模板，用引物nnap2-q-f和nnap2-q-r；所述引物nnap2-q-f和nnap2-q-r的序列分别如seq id no:7和seq id no:8所示；同时以荷花actin基因为内参基因(引物nnactin f和nnactin r，序列分别如seq id no:9和seq idno:10所示)，进行荧光定量pcr检测，反应体系分别为：
11、(1)
12、
13、其中，nnap2-q-f、nnap2-q-r的摩尔浓度均为10μm；
14、(2)内参对照：
15、
16、其中，nnactin f、nnactin r的摩尔浓度均为10μm；
17、两者的反应条件均为：
18、
19、结果如图2显示，荷花nnap2基因主要在花瓣上高表达。其中，le为幼嫩莲叶；fb为花芽；pe为花瓣；pst为瓣化雄蕊，形态趋近正常雄蕊；st为雄蕊；ca为心皮；re为幼嫩莲蓬。
20、基于荷花nnap2基因的转基因载体的构建方法，包括以下依序进行的步骤：
21、(一)克隆获得荷花nnap2基因
22、(1)根据莲基因组中与拟南芥ap2基因同源的序列，设计出引物nnap2-cds-f和nnap2-cds-r；
23、(2)提取荷花品种粉红凌霄的总rna，之后反转录合成cdna，以获得所述cdna为模板，用引物nnap2-cds-f和nnap2-cds-r进行扩增，获得荷花nnap2基因；所述扩增反应体系如下：
24、
25、其中，引物nnap2-cds-f和nnap2-cds-r的摩尔浓度均为10μm，dntp mix的摩尔浓度为10mm；
26、所述扩增反应程序如下：
27、95℃预变性3min；
28、
29、72℃延伸5min；
30、(二)构建过表达载体pmdc83-nnap2
31、(1)构建pmd19-nnap2质粒
32、将所述荷花nnap2基因连入pmd19-t载体，获得pmd19-nnap2质粒；
33、(2)构建过表达载体pmdc83-nnap2
34、①以pmd19-nnap2质粒为模板，在荷花nnap2基因的cds区两端引入pmdc83载体同源臂
35、用引物nnap2-f和nnap2-r对pmd19-nnap2质粒进行扩增，获得引入载体同源臂的pmd19-nnap2质粒，获得引入载体同源臂的nnap2基因；所述引物nnap2-f和nnap2-r的序列分别如seq id no:5和seq id no:6所示；所述扩增反应体系如下：
36、
37、其中，引物nnap2-f和nnap2-r的摩尔浓度均为10μm，dntp mix的摩尔浓度为10mm；
38、所述扩增反应程序如下：
39、95℃预变性3min；
40、
41、72℃延伸5min；
42、②将引入载体同源臂的nnap2基因与经限制性内切酶speⅰ和apaⅰ酶切的pmdc83载体进行重组连接，获得过表达载体pmdc83-nnap2。
43、如图3所示，将pmdc83载体(对照)和获得的表达载体pmdc83-nnap2均使用speⅰ和apaⅰ进行双酶切，酶切后的pmdc83只出现了1条带(lane3、4)，而pmdc83-nnap2载体酶切后出现了2条带，分别为pmdc83载体和nnap2基因(lane1、2)，这证明pmdc83载体和nnap2基因连接成功。同时通过测序确认阳性克隆载体后，即可将过表达载体pmdc83-nnap2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种荷花NnAP2基因，其特征在于：所述荷花NnAP2基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述荷花NnAP2基因的编码蛋白：其特征在于：所述荷花NnAP2基因的编码蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述荷花NnAP2基因的克隆引物，其特征在于：所述荷花NnAP2基因的克隆引物包括NnAP2-CDS-F和NnAP2-CDS-R，NnAP2-CDS-F和NnAP2-CDS-R的序列分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.权利要求1所述荷花NnAP2基因的验证引物，其特征在于：所述荷花NnAP2基因的验证引物包括NnAP2-Q-F和NnAP2-Q-R，NnAP2-Q-F和NnAP2-Q-R的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示。
5.基于荷花NnAP2基因的转基因载体的构建方法，其特征在于：包括以下依序进行的步骤：
6.基于荷花NnAP2基因的转基因载体的应用，其特征在于：将过表达载体pMDC83-NnAP2转入野生型拟南芥，用于使拟南芥
7.根据权利要求6所述的基于荷花NnAP2基因的转基因载体的应用，其特征在于：将过表达载体pMDC83-NnAP2转入野生型拟南芥包括以下依序进行的步骤：将过表达载体pMDC83-NnAP2转入大肠杆菌感受态细胞，获得带有过表达载体pMDC83-NnAP2的大肠杆菌；富集带有过表达载体pMDC83-NnAP2的大肠杆菌，再将带有过表达载体pMDC83-NnAP2的大肠杆菌和根癌农杆菌感受态细胞混合并通过冻融法或电激法，使过表达载体pMDC83-NnAP2转入根癌农杆菌感受态细胞，获得含过表达载体pMDC83-NnAP2的阳性根癌农杆菌，之后使含过表达载体pMDC83-NnAP2的阳性根癌农杆菌通过农杆菌浸花法将过表达载体pMDC83-NnAP2转入野生型拟南芥。
8.基于荷花NnAP2基因的转基因载体的应用，其特征在于：将过表达载体pMDC83-NnAP2转入拟南芥ap2-6突变体，用于恢复拟南芥突变体的花瓣器官。
9.根据权利要求8所述的基于荷花NnAP2基因的转基因载体的应用，其特征在于：将过表达载体pMDC83-NnAP2转入拟南芥ap2-6突变体包括以下依序进行的步骤：将过表达载体pMDC83-NnAP2转入大肠杆菌感受态细胞，获得带有过表达载体pMDC83-NnAP2的大肠杆菌；富集带有过表达载体pMDC83-NnAP2的大肠杆菌，再将带有过表达载体pMDC83-NnAP2的大肠杆菌和根癌农杆菌感受态细胞混合并通过冻融法或电激法，使过表达载体pMDC83-NnAP2转入根癌农杆菌感受态细胞，获得含过表达载体pMDC83-NnAP2的阳性根癌农杆菌，之后使含过表达载体pMDC83-NnAP2的阳性根癌农杆菌通过农杆菌浸花法将过表达载体pMDC83-NnAP2转入拟南芥ap2-6突变体。
...【技术特征摘要】
1.一种荷花nnap2基因，其特征在于：所述荷花nnap2基因的序列如seq id no:1所示。
2.权利要求1所述荷花nnap2基因的编码蛋白：其特征在于：所述荷花nnap2基因的编码蛋白的序列如seq id no:2所示。
3.权利要求1所述荷花nnap2基因的克隆引物，其特征在于：所述荷花nnap2基因的克隆引物包括nnap2-cds-f和nnap2-cds-r，nnap2-cds-f和nnap2-cds-r的序列分别如seq idno:3和seq id no:4所示。
4.权利要求1所述荷花nnap2基因的验证引物，其特征在于：所述荷花nnap2基因的验证引物包括nnap2-q-f和nnap2-q-r，nnap2-q-f和nnap2-q-r的序列分别如seq id no:7和seqid no:8所示。
5.基于荷花nnap2基因的转基因载体的构建方法，其特征在于：包括以下依序进行的步骤：
6.基于荷花nnap2基因的转基因载体的应用，其特征在于：将过表达载体pmdc83-nnap2转入野生型拟南芥，用于使拟南芥花萼和花瓣的数目增多。
7.根据权利要求6所述的基于荷花nnap2基因的转基因载体的应用，其特征在于：将过表达载体pmdc83-nnap2转入野生型拟南芥包括以下依序进行的步骤：将过表达载体pmdc83-nnap2转入大肠杆菌感受态细胞，获得带有过表达载体pmdc83-nnap2...
【专利技术属性】
技术研发人员：林钟员，刘雪莲，秦煜，许惠滨，杨平仿，曹仃仃，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：
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