【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种特殊修饰的质粒及其构建方法，以及该质粒的应用。
技术介绍
1、以下的
技术介绍
介绍仅仅是一些背景常识的介绍，不会对本专利技术构成任何限制。
2、人类疾病的发生发展机制复杂，以人类细胞株进行的体外实验，虽然能了解不同分子之间的相互作用，信号通路涉及的分子，然而无法反映人类疾病的致病性和疾病的发生发展。动物模型的体内实验，能通过动物的表型、体重、病徵、生化指标、mrna和蛋白表达等，反映人类疾病的致病因子和疾病的发生发展的关系，以及药物的治疗效果。动物模型当中，非人灵长类与人类的基因最相似，应是最理想的动物模型，然而实验成本昂贵；小鼠则是较经济的动物模型，然而存在的问题是，小鼠基因组与人类基因组的蛋白质编码区域平均85％相同，某些基因的一致性最高约99％，这对于蛋白药物此类胺基酸层次的研发影响比较小，但是对于对基因一致性有严格要求的小核酸类药物研发则无法满足。因此人源化小鼠模型，是药物临床前开发过程中重要研究工具。
3、目前，建立人源化小鼠模型的常用方法有以下几种：基因敲入人源化的转基因小鼠、通过aav建立人源化的小鼠模型、通过ivh建立人源化的小鼠模型等。
4、基因敲入人源化的转基因小鼠。crispr-cas9基因编辑技术的应用，将小鼠內源基因的基因组dna替换为人源同源基因的基因组dna，有时基因仅替换部分外显子并非全长；或是直接插入人源cdna的策略。crispr介导同源重组技术的出现，提高了敲入外源dna时的靶向性和成功率，因而可以直接进行受精卵注射，减少
5、通过aav建立人源化的小鼠模型。通过将少于3.5kb长度的人源化基因构建在aav表达质粒、aav辅助质粒以及aav rep-cap血清型特异性质粒，进行三质粒转染到细胞中，包装病毒。收集的aav病毒液进行纯化、浓缩以及病毒滴度检测。aav以尾静脉注射感染小鼠造模，一般两周后能表达人源化基因。aav的优势在于不同的血清型具备不同组织器官的特异性，例如aav8对肝细胞具有更高的亲和力，aav8与aav2相较可以将3～4倍高的外源基因转导入肝细胞；尾静脉注射后，aav8可在小鼠肝脏中转导多达90～95％的肝细胞。然而，aav只能暂时性表达无法传代，而且包aav病毒和纯化等技术门槛较高，对生物安全等级有要求，超离等仪器设备成本高，也需要一定的时间。
6、ivh转基因鼠模型。利用小鼠尾静脉流体力学注射(hydrodynamic injection或hydrodynamic gene delivery)，通过快速将大量液体注入血管中产生的动态压力的物理力来透化细胞膜并促进细胞内基因转移。ivh方法是在2～12秒的时间范围内，将表达人源化基因的质粒dna，通过小鼠尾静脉注射入相当于小鼠体重的5～15％的溶液体积，由于注射引起的巨大水动力，肝孔扩大，使遗传物质进入肝细胞。一旦传递的遗传物质进入肝细胞，水动力压力减弱，肝孔闭合，遗传信息被留在细胞内。ivh建立人源化的小鼠模型，在小鼠肝脏表达人源化药物靶标，能极大提升药物疗效的效果评估，尤其适合于基因治疗领域药物的新药开发。与其他更为复杂的人源化小鼠模型相比，ivh建立人源化的小鼠模型可以大幅降低研发成本；并且在数周内完成建模，大量地缩短研发时间。
7、基于ivh途径建立的人源化小鼠模型在人类疾病的发病机理和基因治疗中发挥着不可估量的巨大作用，但是质粒dna被小鼠体内核酸酶大量降解，最终能在肝脏组织表达的外源基因效率低，基因表达时间短稳定度差，这是束缚ivh建立人源化小鼠模型技术发展的主要因素。
8、这就需要对现有的ivh途径进行改进，克服现有技术的一些技术缺陷。
技术实现思路
1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种含有新的增强子或者新的启动子，或者新的增强子与新的启动子组合的的质粒，该质粒可以用于表达该质粒可构建全长mrna转基因鼠，尤其适用于基因治疗领域的新药研发。此类特殊修饰的质粒，避免质粒dna被小鼠体内核酸酶降解，利用此质粒能建立稳定表达的ivh(in vivo humanization)转基因鼠平台，能有效地提高制备小鼠肝脏稳定表达人源化基因，能实现各种人类肝脏基因引起疾病的高效和经济的人源化小鼠的建模。
2、一方面，本专利技术提供了一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为seq no：2所示的序列。
3、进一步地，所示的增强子序列的经甲基化修饰。
4、进一步地，所述的修饰比例为大于60％。
5、进一步地，所述的修饰比例为90％。
6、进一步地，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰。
7、进一步地，所述的修饰比例为90％。
8、因此，本专利技术提供了一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为mersi和mersiii组成的增强子。在一些方式中，所述mersi和mersiii组成的增强子为seqno：2所示的序列。在一些方式中，所示的增强子序列的经甲基化修饰，可以对胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤进行甲基化修饰。修饰的方式可以采用酶的方式或者基因合成的过程进行修饰。这里的甲基化修饰可以胞嘧啶上的修饰，修饰的比例大于60％，例如修饰比例为65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，100％中的任何一种修饰比例。
9、在一些方式中，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰，修饰的比例为大于60％，如修饰比例为65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，100％中的任何一种修饰比例。
10、进一步地，所述的载体还包括启动子，所述的启动子连接在增强子的3’端，所述的启动子选自-282/+36(长318nt)(seq no：8)、alb启动子-203/+25(长228nt)(seq no：7)或者alb启动子-170/+22(长192nt)(seq no：6)中的任意一种。
11、进一步地，所述启动子的序列为seq no：6所示的序列。
12、第二方面，本专利技术提供了一种质粒载体，所述的载体包括启动子，所述的启动子的序列为-282/+36(长318nt)(seq no：8)、alb启动子-203/+25(长228nt)(seq no：7)或者alb启动子-170/+22(长192nt)(seq no：6)所示的序列。
13、进一步地，所述启动子的序列为seq no：6所示的序列。
【技术保护点】
1.一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为SEQ NO：2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的载体，所示的增强子序列的经甲基化修饰。
3.根据权利要求2所述的载体，所述的修饰比例为大于60％。
4.根据权利要求2所述的载体，所述的修饰比例为大于90％。
5.根据权利要求2所述的载体，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰。
6.根据权利要求5所述的载体，所述的修饰比例为大于90％。
7.根据权利要求1所述的载体，所述的载体还包括启动子，所述的启动子连接在增强子的3’端，所述的启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
8.一种质粒载体，所述的载体包括启动子，所述的启动子的序列为-282/+36(长318nt)(SEQ NO：8)、ALB启动子-203/+25(长228nt)(SEQ NO：7)或者ALB启动子-170/+22(长192nt)(SEQ NO：6)所示的序列。
9.根据权利要求7所述的质粒载体，所述的启动子的序列SEQ NO：6所示的序列。
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11.一种质粒载体，所述的载体从5’到3’端依次包括增强子以及启动子，所述的增强子的序列为SEQ NO：1或者SEQ NO：2所示的序列；启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
12.根据权利要求11所示的质粒载体，所述的增强子包括MersI和MersIII。
13.根据权利要求1-12之一所述的质粒载体，所述的载体中还包括目的基因，该目的基因为希望在小鼠体内表达的基因。
14.根据权利要求13所述的质粒载体，所述目的基因包括P基因、PCSK9基因。
15.一种小鼠，其中所述的小鼠包括权利要求1-11任一项所述的质粒载体。
16.根据权利要求15所述的小鼠，所述的质粒载体是经过去内毒素处理的质粒载体。
...【技术特征摘要】
1.一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为seq no：2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的载体，所示的增强子序列的经甲基化修饰。
3.根据权利要求2所述的载体，所述的修饰比例为大于60％。
4.根据权利要求2所述的载体，所述的修饰比例为大于90％。
5.根据权利要求2所述的载体，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰。
6.根据权利要求5所述的载体，所述的修饰比例为大于90％。
7.根据权利要求1所述的载体，所述的载体还包括启动子，所述的启动子连接在增强子的3’端，所述的启动子的序列为seq no：6所示的序列。
8.一种质粒载体，所述的载体包括启动子，所述的启动子的序列为-282/+36(长318nt)(seq no：8)、alb启动子-203/+25(长228nt)(seq no：7)或者alb启动子-170/+22(长192nt)(seq no：6)所示的序列。
9.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：李旭东，曲天华，郭淑明，
申请(专利权)人：杭州一粟生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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