【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵工程，尤其涉及一种14型肺炎链球菌的发酵方法。
技术介绍
1、肺炎链球菌（ streptococcus pneumoniae）是一种具有荚膜的革兰氏阳性球菌，是引起人类肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等疾病的主要病原菌。由肺炎链球菌所导致的疾病具有较高的发病率和死亡率，主要易感人群为5岁以下的婴幼儿。随着肺炎链球菌耐药性的日趋加重，通过接种疫苗来预防其感染日益受到重视。荚膜多糖是肺炎链球菌的关键毒力因子，将肺炎链球菌发酵罐培养后，经提取分离、纯化以及结合制成的多糖或多糖结合疫苗能够有效诱导人体免疫反应，从而预防肺炎链球菌的感染以及发病。
2、在肺炎荚膜多糖生产中，肺炎链球菌的发酵是影响荚膜多糖产量的关键步骤。微生物的发酵是非常复杂的系统，受到众多因素的影响，其中主要影响因素包括：菌种、培养基成分、补料培养基成分、培养ph值、培养温度、通气与搅拌、分批，补料或流加等。同时肺炎链球菌荚膜多糖的合成更是由多个因素进行综合调控的结果，代谢途径也比较复杂。研究表明，肺炎链球菌荚膜多糖的产量与菌体浓度并不是成简单的正比关系，即在肺炎链球菌最适的生长条件下，其荚膜多糖的产量并不一定是最高的（柴雁菁,左智洁,马波等.肺炎链球菌5型发酵工艺的优化[j].现代生物医学进展,2012,12(09):1660-1664.doi:10.13241/j.cnki.pmb.2012.09.002）。因此，需要通过多种影响因素的共同优化，以达到肺炎链球菌的生长以及荚膜多糖合成的最优组合
3、不同型别的肺炎链球菌生产荚膜多糖所需的发酵工艺存在明显差异。目前已有的肺炎链球菌的发酵工艺中，14型肺炎链球菌荚膜多糖的产量仍较低。专利申请wo2011151841a1公开了一种肺炎链球菌发酵工艺，其中14型肺炎链球菌在发酵过程中可以达到的生物量为0.9-15.0，多糖产量为0.2-0.25g/l；在maria et al的研究中，通过培养基以及培养工艺的优化，14型肺炎链球菌多糖的产量可以达到185.2 mg/l（leal, m.m.;pereira, d.s.g.; jessouroun, e.; couto, m.a.p.g. and pereira, n. (2011).investigation of cultivation conditions for capsular polysaccharideproduction by streptococcus pneumoniae serotype 14. electronic journal ofbiotechnology,vol. 14,no.5. http://dx.doi.org/10.2225/vol14-issue5-fulltext-6）；专利申请cn108473945a公开了通过使用改良的as3培养基、将发酵温度控制在36℃、ph控制在7.0、使用naoh作为碱滴定剂、将发酵罐用空气进行惰化，并在200 rpm下搅拌发酵，14型肺炎链球菌的生长密度od600可以达到6.8，多糖的发酵产量可达1.1g/l。
4、有研究表明，灌注发酵能够将培养物通过灌注系统进行循环，除去用完的培养基和废物产物，并通过引入新鲜培养基来维持培养体积，灌注发酵能够极大地提升肺炎链球菌的生长密度，od600可以达到30，相应的多糖产量可以达到2.2 g/l（参见专利申请cn108473945a）。然而，由于灌注发酵的操作复杂，而且耗材成本较高，且发酵罐外的灌注系统循环过程中的无菌操作非常复杂，因此在实际的生产工艺中经常使用分批发酵（batch）或补料分批发酵（fed-batch）这两种模式。专利申请cn104080904a公开了通过一系列的工艺优化，14型肺炎链球菌荚膜多糖的分批发酵产量为450mg/l，补料分批发酵可达1100 mg/l。
5、综上所述，有必要对目前的14型肺炎链球菌发酵工艺进行进一步优化，以提高其荚膜多糖的产率。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种14型肺炎链球菌的发酵方法。
2、具体地，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种14型肺炎链球菌的发酵方法，所述方法包括：在14型肺炎链球菌的发酵过程中，以补料培养基进行补料；
4、所述补料培养基包括如下组分：葡萄糖 180-220g/l，酵母提取物 100-150g/l，大豆蛋白胨 100-150g/l，氨基酸 1.1-1.5g/l，镁盐 0.3-0.8g/l，亚铁盐 0.05-0.2g/l，锌盐0.01-0.02g/l，锰盐 5-10g/l。
5、为提高14型肺炎链球菌的荚膜多糖的产量，本专利技术首先对补料培养基进行了优化。在研发过程中，本专利技术发现，与以往的普遍认知不同（发酵中后期肺炎链球菌的生长和代谢变慢，所需营养降低，无需高浓度碳氮源补料，例如wo2011151841a1），在补料过程中使用较高浓度的碳源和氮源，配合特定种类和浓度的无机盐离子供给（尤其是高浓度的锰离子），能够更好地平衡14型肺炎链球菌的生长和荚膜多糖的合成，显著提高荚膜多糖的产量。经实验验证，将补料培养基中的碳源和氮源以及无机盐控制在上述浓度范围内，荚膜多糖的产量得到明显提升。
6、以上所述的氨基酸包括l-谷氨酰胺和天冬酰胺。
7、优选地，所述补料培养基还包括氯化胆碱和还原剂。
8、对于以上所述的无机盐的选择，本领域技术人员知晓，上述无机盐的作用在于提供对应的金属离子（镁离子、亚铁离子、锌离子、锰离子），因此，上述金属离子的任意盐均可以实现预期的效果。示例性地，镁盐可选自硫酸镁、氯化镁、醋酸镁中的一种或多种，亚铁盐可选自硫酸亚铁、氯化亚铁、醋酸亚铁中的一种或多种，锌盐可选自硫酸锌、氯化锌、醋酸锌中的一种或多种，锰盐可选自硫酸锰、氯化锰中的一种或多种。
9、优选地，所述补料培养基包括如下组分：葡萄糖 180-220g/l，酵母提取物 100-150g/l，大豆蛋白胨 100-150g/l，l-谷氨酰胺 0.46-0.52g/l，天冬酰胺 0.7-0.9g/l，mgso4·7h2o 0.45-0.53g/l，feso4·7h2o 0.09-0.11g/l，znso4·7h2o 0.015-0.017g/l，mnso4·h2o 6.8-7.6g/l，巯基乙酸 0.18-0.22ml/l，氯化胆碱 0.01-0.03 g/l。
10、对于上述补料培养基中的无机盐，可以替换为对应金属离子的其他盐形式（例如硫酸盐可以替换为盐酸盐、醋酸盐等），替换后无机盐的浓度可根据上述硫酸盐中所含金属离子的浓度和分子量进行换算。本领域技术人员可以理解，相同金属离子的不同盐种类替换应该属于本专利技术技术方案的等同替代，同样属于本专利技术的保护范围。此外，无机盐可以使用所述无机盐的结晶水合物，也可以使用不带结晶水的无机盐，根据上述结晶水合物的用量，本领域技术人员能够换算得到使用对应的不带结晶水的无机本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：在14型肺炎链球菌的发酵过程中，以补料培养基进行补料；
2.根据权利要求1所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述氨基酸包括L-谷氨酰胺和天冬酰胺；
3.根据权利要求2所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基包括如下组分：葡萄糖 180-220g/L，酵母提取物 100-150g/L，大豆蛋白胨 100-150g/L，L-谷氨酰胺 0.46-0.52g/L，天冬酰胺 0.7-0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.45-0.53g/L，FeSO4·7H2O0.09-0.11g/L，ZnSO4·7H2O 0.015-0.017g/L，MnSO4·H2O 6.8-7.6g/L，巯基乙酸 0.18-0.22mL/L，氯化胆碱 0.01-0.03 g/L。
4.根据权利要求1~3任一项所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述补料为连续补料，所述补料的速率以维持发酵体系中葡萄糖的浓度不低于5g/L为准。
5.根据权利要求1~3任一项所述的14
6.根据权利要求5所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，在所述发酵过程中，以0.08-0.12 VVM的通气比通入氮气。
7.根据权利要求1~3、6任一项所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵的温度为36.5-37.5℃。
8.根据权利要求1~3、6任一项所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述发酵的pH为6.6-7.3；
9.权利要求1~8任一项所述的14型肺炎链球菌的发酵方法的以下任一种应用：
10.一种14型肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1~8任一项所述的14型肺炎链球菌的发酵方法对14型肺炎链球菌进行发酵，在发酵结束后对发酵液进行杀菌处理，收集其中的荚膜多糖，经纯化获得精制荚膜多糖，或者经纯化和降解获得荚膜多糖降解多糖。
...【技术特征摘要】
1.一种14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：在14型肺炎链球菌的发酵过程中，以补料培养基进行补料；
2.根据权利要求1所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述氨基酸包括l-谷氨酰胺和天冬酰胺；
3.根据权利要求2所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基包括如下组分：葡萄糖 180-220g/l，酵母提取物 100-150g/l，大豆蛋白胨 100-150g/l，l-谷氨酰胺 0.46-0.52g/l，天冬酰胺 0.7-0.9g/l，mgso4·7h2o 0.45-0.53g/l，feso4·7h2o0.09-0.11g/l，znso4·7h2o 0.015-0.017g/l，mnso4·h2o 6.8-7.6g/l，巯基乙酸 0.18-0.22ml/l，氯化胆碱 0.01-0.03 g/l。
4.根据权利要求1~3任一项所述的14型肺炎链球菌的发酵方法，其特征在于，所述补料为连续补料，所述补料的速率以维持发酵体系中葡萄...
【专利技术属性】
技术研发人员：李跃龙，曹欣，徐永学，王剑龙，王研研，刘艳丽，周也驰，刘建凯，郑海发，
申请(专利权)人：北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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