【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，尤其涉及一种卤醇脱卤酶突变体、编码基因、重组质粒、基因工程菌及其应用。
技术介绍
1、手性2-噁唑烷酮及其衍生物不仅是一类非常重要的手性辅剂(evans手性辅剂)，被广泛应用于构建各种手性化合物, 而且还是一种重要的杂环结构单元, 广泛存在于许多手性药物、天然产物和生物活性分子中。手性卤代醇和手性环氧是重要的旋光性模块化合物，可用于合成大量生物活性分子，广泛应用于医药化学品、农用化学品、食品及功能材料等行业目前制备该手性2-噁唑烷酮及其衍生物的常用方法是从手性原料β-氨基醇及其衍生物出发，利用亲电性的“c＝o”试剂进行羰基化反应。但该方法往往涉及到使用光气及其衍生物、一氧化碳等剧毒和危险的羰基化试剂或者使用二氧化碳等作为羰基来源在高温高压的苛刻条件下反应。传统的手性环氧和手性卤代醇化学合成方法使用金属催化剂，毒性大，对环境污染严重，并且反应条件苛刻，往往需要较高的反应温度和较长的反应时间，反应收率低，同时反应的立体选择性不高。绿色催化中以生物催化剂代替传统方法合成手性光学纯的环氧化物和噁唑烷酮，具有立体选择性高、反应过程环保、反应条件温和、反应速度快、耗时短、产品易于分离等优点，被广泛应用到各行各业中。
2、卤醇脱卤酶（halohydrin hydrogen halide lyase）广泛应用于1,3-二氯-2-丙醇、表卤醇和1,2-二溴乙烷等许多重要的卤代醇污染物的生物降解中，具有广泛的应用前景，还可以在亲核试剂（n3-、cn-、ocn-、no2-）的介导下对环氧化物进行拆分。目前已报道的卤
技术实现思路
1、本申请的目的在于提供一种高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用，旨在解决现有卤醇脱卤酶在催化合成( r)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇、( s)-邻硝基苯基缩水甘油醚、( s)-对硝基苯基缩水甘油醚、( s)-4-(苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮、( s)-4-(2-硝基苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮、( s)-4-(4-硝基苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮时催化活力和选择性低，催化合成拆分的纯度和收率低，反应时间长的技术问题。
2、为实现上述目的，本申请所提供的技术方案为：
3、本申请的第一方面提供了一种卤醇脱卤酶突变体。该卤醇脱卤酶突变体是以seqid no:1所示的原始卤醇脱卤酶的氨基酸序列为载体，对所述氨基酸序列进行以下组合突变：
4、i：将第103位的亮氨酸突变为组氨酸；
5、ii：将第196位的天冬酰胺突变为色氨酸；
6、在第一方面可选实现方式中，所述卤醇脱卤酶突变体的氨基酸序列如seq id no:3所示。
7、本申请的第二方面提供第一方面所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因。该编码基因为seq id no:4所示。
8、本申请的第三方面提供一种包含第二方面所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因的重组质粒。
9、在第三方面可选的实现方式中，所述重组质粒的表达载体为pet28a(+)。
10、本申请的第四方面提供一种包含第二方面所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因的基因工程菌。
11、本申请的第五方面提供第四方面所述基因工程菌在催化合成拆分( r)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇、( s)-邻硝基苯基缩水甘油醚、( s)-对硝基苯基缩水甘油醚、( s)-4-(苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮、( s)-4-(2-硝基苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮、( s)-4-(4-硝基苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮中的应用。
12、本申请第一方面提供的卤醇脱卤酶突变体，通过对seq id no:1所示的原始卤醇脱卤酶的氨基酸序列进行所述的组合突变，使得氨基酸及其相关的核苷酸序列产生定向的结构与功能化改变，大幅度提高了卤醇脱卤酶突变体的催化活力和立体选择性，相较卤醇脱卤原始酶的催化合成拆分的纯度和收率更高。其中，催化拆分底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的对映体选择率大于200，催化生成的( r) -1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的ee值大于98%，生成的产物( s)-4-(苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮ee值大于99%，且收率>40%。
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1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒携带如权利要求2或3任一项所述的基因。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒的表达载体为pET28a (+)。
6.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达如权利要求4或5中所述的质粒。
7.权利要求6所述的基因工程菌作为催化剂的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以权利要求6中所述的基因工程菌作为催化剂，催化合成拆分(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇，(S)-邻硝基苯基缩水甘油醚和(S)-对硝基苯基缩水甘油醚，(S)-4-(苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮，(S)-4-(2-硝基苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮和(S)-4-(4-硝基苯氧基甲基)-2-恶唑烷酮。>...
【技术特征摘要】
1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:3所示。
2.一种编码基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:4所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒携带如权利要求2或3任一项所述的基因。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒的表达载体为pet28a (+)。
6...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，郑媛元，薛锋，宋金松，徐晴，
申请(专利权)人：南京师范大学常州合成生物学产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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