【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞，特别是涉及一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用。
技术介绍
1、干细胞外泌体是来自干细胞的一种细胞分泌物，外泌体是干细胞分泌微小的囊泡(宽30至150纳米)，它带上有干细胞的蛋白、mrna和microrna等生物活性化学物质，具备干细胞的一些功能。外泌体合乎纳米颗粒的界定，干细胞外泌体可以透过血脑屏障，是干细胞与别的细胞中间信息内容传送的关键物质，有利于干细胞功能的完成。它们类似细胞间的“通信兵”可以在细胞之间转移dna，rna或蛋白质，从而影响受体细胞的功能，在干细胞和再生医学领域，外泌体正在被用于以治疗从心脏病到呼吸系统疾病的疾病。
2、但是现有的干细胞外泌体制备的方法，一般是使用差速离心，由于样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，从而使得制备的外泌体的纯度不是很高，制备时间过长，从而影响实验结果。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用，解决了现有技术中的具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，制备的外泌体的纯度不是很高，制备时间过长技术问题。
2、为达上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用，包括
4、步骤一：采用含血清培养基培养干细胞，
5、步骤二：祛除步骤一中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，制备剩下部分；根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.7μm、0.45μm或0.21μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于制备液体，将制备液放置无菌存放盒中；
6、步骤三：将步骤二中得到的培养上清液进行第一次离心处理，制备上清液，能够去除杂质细胞和凋亡的细胞碎；清液的第一次离心处理，采用300g的离心力，离心处理8～10min；
7、步骤四：对步骤三中得到的上清液进行第二次离心处理，制备上清液，能够去除较大的囊泡；清液的第二次离心处理，采用2000g的离心力，离心处理8～10min；
8、步骤五：采用细胞分选装置对步骤四得到的上清液进行筛分，将其中残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液；采用两个串联的细胞分选装置进行筛分对制备液进行纯化，细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成，第一个细胞分选装置的声波频率较低，用来去除样本中残留的细胞和血小板；第二个细胞分选装置的声波频率较高，将样本中的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来，得到含有外泌体的纯化制备液；
9、步骤六：将步骤五种获取的制备液采用peg溶液混合在4℃无菌恒温条件下孵育将孵育后的制备液通过低速离心即可沉淀回收外泌体，得到高纯度的干细胞外泌体；peg溶液的浓度为0.25g/ml，peg溶液的配制方法为：按照0.25g/ml的浓度比例，称取peg8000溶解于milli-q超纯水中，121℃条件下湿热灭菌30min；获取的peg溶液保存在4℃的恒温无菌环境中；外泌体孵育的时间为8～10h；外泌体制备的离心条件为：500g的离心力，离心处理8～10min。
10、一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法所制备的外泌体在制备用于皮肤创伤的治疗的制剂中的应用；皮肤创伤为表皮、真皮或皮下组织的创伤。
11、本专利技术的实施例具有以下有益效果：
12、本专利技术的制备方法对干细胞进行两次无菌培养，能够获取较为纯净且外泌体含量较高的制备液，为后续步骤做好准备；进行两次除杂处理，能够有效去除杂质和囊泡，保证外泌体的纯度；进行筛选处理，能够将残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液，进一步提高外泌体纯度；对外泌体进行孵育，便于外泌体的最终制备，制备方便，耗时短，能够提高干细胞外泌体的制备速度；本制备方法在二次除杂后采用细胞分选装置对制备液进行纯化，能够提高外泌体的纯度，且该操作耗时短，操作方便；纯化后的制备液采用peg溶液孵育后进行低速离心沉淀分离即可获取干细胞外泌体，不需要进行长时间的超高速离心分离进行制备，且制备的外泌体纯度高，能够大大提高制备效率。
13、当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
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1.一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤一中，向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，12～24h后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养12～36h，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养24～48h将培养后的干细胞放置在采血袋中。
3.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤二中，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.7μm、0.45μm或0.21μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于制备液体，将制备液放置无菌存放盒中。
4.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤三中上清液的第一
5.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤四中上清液的第二次离心处理，采用2000g的离心力，离心处理8～10min。
6.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤五中，采用两个串联的细胞分选装置进行筛分对制备液进行纯化，细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成，第一个细胞分选装置的声波频率较低，用来去除样本中残留的细胞和血小板；第二个细胞分选装置的声波频率较高，将样本中的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来，得到含有外泌体的纯化制备液。
7.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤六中，PEG溶液的浓度为0.25g/ml，PEG溶液的配制方法为：按照0.25g/ml的浓度比例，称取PEG8000溶解于Milli-Q超纯水中，121℃条件下湿热灭菌30min；获取的PEG溶液保存在4℃的恒温无菌环境中。
8.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤六中外泌体孵育的时间为8～10h；在步骤六中外泌体制备的离心条件为：500g的离心力，离心处理8～10min。
9.如权利要求1-8中任一项所述方法所制备的外泌体在制备用于皮肤创伤的治疗的制剂中的应用。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述皮肤创伤为表皮、真皮或皮下组织的创伤。
...【技术特征摘要】
1.一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，包括：
2.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤一中，向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，12～24h后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养12～36h，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养24～48h将培养后的干细胞放置在采血袋中。
3.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤二中，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.7μm、0.45μm或0.21μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于制备液体，将制备液放置无菌存放盒中。
4.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤三中上清液的第一次离心处理，采用300g的离心力，离心处理8～10min。
5.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤四中上清液的第二...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄子钰，
申请(专利权)人：厦门鑫兆康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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