【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，涉及病毒检测，具体涉及一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测引物组合、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、新型冠状病毒引起的肺炎（covid-19）是由sars-cov-2导致的一种急性传染病。目前，临床检测发现很多患者存在“复阳”的情况，这些复阳病例是否具有传染性也仍未知。现有国内外监测数据均表明，新冠复阳病例的标本中很难再分离出有生物学活性的新冠病毒（活病毒），大多数复阳病例很可能都属于间歇性排毒，甚至只是一些病毒残留的核酸片段。因此从分子水平进行快速而准确的诊断、鉴别有生物学活性的新冠病毒和无有生物学活性的新冠病毒核酸片段是控制传播的关键工具。
2、研究表明，sars-cov-2的基因组由6个主要的功能性开放阅读框(orf)组成，包括orf1ab、s、e、m、n和其他辅助基因，其中orf1ab、刺突蛋白(s蛋白)和膜蛋白(m蛋白)在病毒感染与致病中发挥着重要作用。sars-cov-2病毒感染后在宿主细胞内增殖，除产生大量基因组rna外，还会产生一些的亚基因组信使rna（sgrna），用以表达病毒生命活动所必需的各种蛋白。研究显示，亚基因组在结构上由病毒5’utr区leader序列及各基因转录rna片段构成，亚基因组的出现可反应病毒复制状态，从而代表病毒的感染性。然而，报道显示，现有的检测方法，在患者感染早期可以检测出sgrnas，感染后期检测不到sgrnas。这说明sgrnas的存在是sars-cov-2活动性复制的标志，而非残留的病毒rna，而新型冠状病毒亚基因组中各基因表达量差异较大
技术实现思路
1、基于上述存在的问题及目的，本专利技术提供一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测引物组合、试剂盒及检测方法；同时检测新型冠状病毒亚基因组sgrna-e基因以及基因组orf1ab基因，以快速检测sars-cov-2病毒增值的标志——sgrna-e，以鉴定患者标本中的新冠病毒是否具有生物学活性，判断其是否感染性，为传播的控制提供重要支持。具体技术方案如下：
2、首先，本专利技术提供一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测引物组合，包括新冠sgrna-e基因检测引物探针组分和新冠orf1ab基因检测引物探针组分，用于同时检测新型冠状病毒亚基因组sgrna-e基因以及新型冠状病毒基因组orf1ab基因；
3、所述新冠sgrna-e基因检测引物探针组分中上游引物、下游引物和探针的核酸序列如seq no.1～seq no.3所示；
4、所述新冠orf1ab基因检测引物探针组分中上游引物、下游引物和探针的核酸序列如seq no.4～seq no.6所示。
5、其次，本专利技术提供一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，含有前述的pcr检测引物组合；且，按体积计：
6、新冠sgrna-e基因检测引物探针组分中上游引物、下游引物、探针的配比为：
7、上游引物:下游引物:探针=0.032～0.128:0.032～0.128:0.012～0.08；
8、新冠orf1ab基因检测引物探针组分中上游引物、下游引物、探针的配比为：
9、上游引物:下游引物:探针=0.032～0.128:0.032～0.128:0.012～0.08；
10、优选地，
11、新冠sgrna-e基因检测引物探针组分中上游引物、下游引物、探针的配比为：
12、上游引物:下游引物:探针=0.05～0.112:0.05～0.112:0.02～0.06；
13、新冠orf1ab基因检测引物探针组分中上游引物、下游引物、探针的配比为：
14、上游引物:下游引物:探针=0.03～0.112:0.048～0.128:0.02～0.08。
15、前述的新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，所述新冠sgrna-e基因检测引物探针组分和所述新冠orf1ab基因检测引物探针组分用量的体积比为0.05～0.25:0.05～0.25；优选为0.1～0.25:0.10～0.25。
16、前述的新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，该试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品；
17、所述反应缓冲液为2×one step rt-qpcr probe buffer iv；
18、所述酶混合液为逆转录酶和热启动taq酶；
19、所述阴性质控品为不含rnase和dnase的纯化水；
20、所述阳性质控品为含有新型冠状病毒亚基因组sgrna-e和新型冠状病毒基因组orf1ab基因检测靶序列的重组质粒。
21、前述的新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，所述阳性质控品的构建与制备方法为：
22、利用前述的新冠sgrna-e基因检测引物和新冠orf1ab基因检测引物，分别pcr扩增新型冠状病毒的亚基因组sgrna-e和基因组orf1ab基因；
23、将pcr扩增产物克隆至pmd-18t载体，获得重组质粒；
24、再将所述重组质粒转化入dh5α大肠杆菌培养，采用碱裂解法提取阳性克隆质粒；
25、然后测定计算质粒浓度与纯度，稀释至200拷贝每微升，即为阳性质控品。
26、再次，本专利技术提供一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测方法，使用前述的pcr检测试剂盒进行检测。
27、优选地，该检测方法的反应体系为：
28、2×one step rt-qpcr probe buffer iv 10µl，
29、酶混合液 2µl；
30、pcr检测引物组合 0.45µl，
31、样品rna 2µl，
32、加灭菌水至终体系 20µl。
33、优选地，该检测方法的pcr的扩增程序为：
34、逆转录阶段：50℃，5min；
35、预变性阶段：95℃，30sec；
36、预扩增阶段：变性95℃，5sec；退火50℃，20sec；共5个循环；该阶段不采集荧光信号；
37、检测阶段：变性95℃，5sec；退火56℃，20sec；共40个循环；该阶段在退火步骤检测荧光信号。
38、优选地，该检测方法的样本为临床样本，类型包括咽拭子、痰液和支气管肺泡灌洗液。
39、优选地，该检测方法的质量控制方式为：每次实验设立阴、阳性对照，阴性对照无ct值或ct值为0，阳性对照ct值≤30，否则实验结果不成立；
40、检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测引物组合，其特征在于：包括新冠sgRNA-E基因检测引物探针组分和新冠ORF1ab基因检测引物探针组分，用于同时检测新型冠状病毒亚基因组sgRNA-E基因以及新型冠状病毒基因组ORF1ab基因；
2.一种新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的PCR检测引物组合；且，按体积计：
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：按体积计：
4.根据权利要求2或3所述的新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述新冠sgRNA-E基因检测引物探针组分和所述新冠ORF1ab基因检测引物探针组分用量的体积比为0.05～0.25:0.05～0.25。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述新冠sgRNA-E基因检测引物探针组分和所述新冠ORF1ab基因检测引物探针组分用量的体积比为0.1～0.25:0.10～0.25。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒双重快速荧光P
7.根据权利要求4所述的新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品的构建与制备方法为：
8.一种新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测方法，其特征在于：使用权利要求2-5任意一项所述的PCR检测试剂盒进行检测。
9.根据权利要求8所述的新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测方法，其特征在于：该检测方法，
10.根据权利要求8所述的新型冠状病毒双重快速荧光PCR检测方法，其特征在于：该检测方法的质量控制方式为：每次实验设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值或Ct值为0，阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立；
...【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测引物组合，其特征在于：包括新冠sgrna-e基因检测引物探针组分和新冠orf1ab基因检测引物探针组分，用于同时检测新型冠状病毒亚基因组sgrna-e基因以及新型冠状病毒基因组orf1ab基因；
2.一种新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述的pcr检测引物组合；且，按体积计：
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：按体积计：
4.根据权利要求2或3所述的新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：所述新冠sgrna-e基因检测引物探针组分和所述新冠orf1ab基因检测引物探针组分用量的体积比为0.05～0.25:0.05～0.25。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒双重快速荧光pcr检测试剂盒，其特征在于：所述新冠sgrna-e基因检测引物探...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁小静，张倩，杨扬，戴舒雅，
申请(专利权)人：江苏和创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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