【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因，具体涉及一种中华鲟实时荧光定量pcr内参基因及其筛选方法和应用。
技术介绍
1、中华鲟是一种大型江河洄游性鱼类，是反映海洋与河流生态状况的重要指示性物种。1988年被列为国家一级重点保护野生动物。因此，积极主动地保护中华鲟种群的生存和发展，对于维护生物多样性，维持长江生态系统平衡，实现人与自然的和谐发展具有重要的意义。
2、实时荧光定量pcr（real-time quantitative pcr，qrt-pcr）以其特异性强、灵敏度高、重现性好等优点成为基因表达研究中的一项重要技术手段。为了减少实验误差，提高qrt-pcr数据的准确性，需要引入内参基因作为参照物来对数据进行标准化和校正。内参基因也叫管家基因，在生物体的各类细胞中都表达。这类基因的表达水平受环境因素的影响较小，在生物体的各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达。当前，在动植物中，被广泛使用的内参基因包括β肌动蛋白（ β-actin）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（ gapdh）、18s核糖体rna（ 18s rrna）、α微管蛋白（ α-tubulin）、核糖体蛋白l15（ rpl15）、延伸因子1α（ ef1α）等。在中华鲟的实时荧光定量pcr研究中，使用最多的内参基因为 β-actin。在实际研究中发现， β-a
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种中华鲟实时荧光定量pcr内参基因及其筛选方法和应用，针对中华鲟不同组织间的差异，开发出稳定表达的内参基因，对于进一步开展中华鲟的分子生物学研究，推进中华鲟人工保护具有重要的意义。
2、为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：所述的内参基因为gapdh、ef1α和rps18中的至少两种组合；其中gapdh的dna序列如seq id no.6所示，ef1α的dna序列如seq id no.5所示；rps18的dna序列如seq id no.8所示。
3、进一步地，其中gapdh的正向引物和反向引物分别如seq id no.19和seq idno.20所示，ef1α的正向引物和反向引物分别如seq id no.17和seq id no.18所示，rps18的正向引物和反向引物分别如seq id no.23和seq id no.24所示。
4、进一步地，所述的内参基因为gapdh和ef1α。
5、进一步地，所述的内参基因为gapdh和rps18。
6、本专利技术还涉及所述内参基因的筛选方法，包括以下步骤：
7、1）利用中华鲟不同组织的转录组数据，获得鱼类常用的内参基因的保守序列，利用引物设计软件，并遵循实时荧光定量pcr引物设计原则设计8对荧光定量特异引物，并对引物的扩增产物进行验证；
8、2）以中华鲟cdna为模板，经过倍比稀释成梯度浓度后，用于qrt-pcr检测，通过绘制引物的标准曲线和熔解曲线来评价8对内参基因引物扩增效率；
9、3）分别采集中华鲟不同组织样品，提取总rna，随后反转成cdna，以反转后的cdna为模板，进行实时荧光定量pcr检测，获得中华鲟不同组织的ct值；
10、4）使用genorm、normfinder、bestkeeper、delta ct和reffinder方法评价内参基因表达稳定性分析，筛选得到最稳定的中华鲟内参基因和内参基因组合。
11、进一步地，步骤2）中的8对的内参基因为 β-actin、 α-tubulin、 18s rrna、 rpl15、 ef-1α、 gapdh、rpl17和 rps18。
12、进一步地，步骤1）所述的引物设计软件包括但不限于primer premier 5.0。
13、进一步地，步骤2）所述的倍比稀释为：将cdna按照1:9的比例稀释5个梯度，具体为1，1/10，1/100，1/1000和1/10000。
14、进一步地，步骤2）中内参基因引物扩增效率在90%-110%之间。
15、本专利技术还涉及所述内参基因在微塑料处理条件下在中华鲟不同组织中基因研究中的应用。
16、本专利技术具有以下有益效果：
17、本专利技术通过中华鲟的转录组数据库，选择了常用作鱼类内参基因的8个候选基因。通过5种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了中华鲟不同组织中稳定表达的荧光定量内参基因，同时评估了候选内参基因在微塑料处理条件下在中华鲟不同组织中的表达稳定性。本专利技术设计的内参基因引物具有适用性广、扩增效率高、在健康组和处理组的中华鲟个体中均能稳定表达的优点，解决了中华鲟荧光定量pcr研究中缺乏稳定有效内参基因的问题。
18、通过本专利技术筛选到的gapdh、ef1α、rps18内参基因，在中华鲟两种处理条件下的不同组织中均稳定表达，可以应用于荧光定量pcr研究。
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1.中华鲟实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：所述的内参基因为GAPDH、EF1α和RPS18中的至少两种组合；其中GAPDH的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，EF1α的DNA序列如SEQID NO.5所示；RPS18的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的中华鲟实时荧光定量PCR内参基因，其特征在于：其中GAPDH的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示，EF1α的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示，RPS18的正向引物和反向引物分别如SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24所示。
3.根据权利要求1或2所述的中华鲟实时荧光定量PCR内参基因，所述的内参基因为GAPDH和EF1α。
4.根据权利要求1或2所述的中华鲟实时荧光定量PCR内参基因，所述的内参基因为GAPDH和RPS18。
5.权利要求1~4任意一项所述内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的筛选
7.根据权利要求5所述的筛选方法,其特征在于：步骤1）所述的引物设计软件包括但不限于Primer Premier 5.0。
8.根据权利要求5所述的筛选方法,其特征在于：步骤2）所述的倍比稀释为：将cDNA按照1:9的比例稀释5个梯度，具体为1，1/10，1/100，1/1000和1/10000。
9.根据权利要求5所述的筛选方法,其特征在于：步骤2）中内参基因引物扩增效率在90%-110%之间。
10.权利要求1~4任意一项所述内参基因在微塑料处理条件下在中华鲟不同组织中基因研究中的应用。
...【技术特征摘要】
1.中华鲟实时荧光定量pcr内参基因，其特征在于：所述的内参基因为gapdh、ef1α和rps18中的至少两种组合；其中gapdh的dna序列如seq id no.6所示，ef1α的dna序列如seqid no.5所示；rps18的dna序列如seq id no.8所示。
2.根据权利要求1所述的中华鲟实时荧光定量pcr内参基因，其特征在于：其中gapdh的正向引物和反向引物分别如seq id no.19和seq id no.20所示，ef1α的正向引物和反向引物分别如seq id no.17和seq id no.18所示，rps18的正向引物和反向引物分别如seq idno.23和seq id no.24所示。
3.根据权利要求1或2所述的中华鲟实时荧光定量pcr内参基因，所述的内参基因为gapdh和ef1α。
4.根据权利要求1或2所述的中华鲟实时荧光定量pcr内参基因，所述的内参基因为gapdh和...
【专利技术属性】
技术研发人员：成旭，杨菁，姜伟，陈沛，舒婷婷，肖衎，黄红涛，史雪涛，
申请(专利权)人：中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，
类型：发明
国别省市：
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