【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养，特别涉及一种用于细胞培养的明胶微载体的制备方法。
技术介绍
1、微载体培养技术广泛应用于生产疫苗、基因工程产品等。微载体培养是目前公认最具发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，且容易放大。该技术已广泛用于培养各类型细胞，如293细胞、成肌细胞、vero细胞、cho细胞等。
2、微载体是指直径60-500μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。目前市场上微载体材料多种多样，按照结构可分为实心微球微载体和多孔微载体。细胞在实心微载体表面进行粘附和生长，生长空间相对较小，而且细胞裸露在载体表面，容易受碰撞等外在因素影响。多孔微载体具有立体多孔结构，细胞可以在载体内部粘附和增殖，可供细胞生长的表面积更大，细胞在载体内部能够获得稳定的生长环境，因此相较实心微载体多孔微载体具有更多的优势。
3、明胶来源于胶原，作为一种天然的生物材料，其具有生物可降解性、生物相容性、凝胶性和低成本等优点，是在医药领域应用广泛的一种传统生物材料。由于明胶分子结构中存在广泛的rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)识别位点，细胞对明胶具有良好的亲和性，即使在其它材料表面贴壁较差的细胞也能很好的在明胶表面生长，因此用明胶作为细胞培养微载体的原料具有非常大的优势。
4、将明胶用于微载体培养已有相关报道。例如，中国专利cn107073165a和cn114516974a公布了多孔明胶微载体的制备方法，两者均是通过加入乳化剂将明胶水相在油相中乳化成大小合适的小液滴，并辅以冷冻造孔技术制备多孔明
技术实现思路
1、针对现有技术存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供了一种操作简单、绿色环保、成本低廉的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，制备的明胶微载体具有贯通大孔结构，解决了上述传统乳化法或喷雾干燥法在制备明胶微球和微载体过程中存在的技术问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面提供了一种用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，包括以下步骤：
4、s1、将明胶颗粒加入水中，加热搅拌，使明胶完全溶解，配制明胶溶液；
5、s2、将配制的明胶溶液进行喷雾、一次冷冻，得到明胶冰冻微球；
6、s3、将得到的明胶冰冻微球加入冷水中进行化冰与分散，得到微孔明胶凝胶微球；
7、s4、将得到的微孔明胶凝胶微球分散到纯净水中，并加入交联剂进行二次冷冻并交联固化；
8、s5、将二次冷冻并交联固化后得到的明胶冰冻溶液进行化冰，洗涤，冷冻干燥，得到明胶微载体。
9、优选地，所述明胶的种类包括但不限于猪皮、鱼皮等动物来源的明胶，植物来源的明胶或基因重组明胶也可以。
10、优选地，所述明胶溶液可以为酸性、碱性或者中性，进一步优选为中性。
11、优选地，为了使得所述明胶溶液呈中性，需加入ph调节剂，所述ph调节剂包括但不限于碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸等中的一种或两种以上的组合。
12、优选地，为了控制明胶溶液冷冻时冰晶形成的大小，在配制明胶溶液的过程中还加入了晶型生长控制剂，所述晶型生长控制剂包括但不限于氯化钠、氯化钙、氯化钾、二甲基亚砜、甘油等其中的一种或两种以上的组合。
13、优选地，所述晶型生长控制剂的加入量为明胶溶液总质量的0.1～1wt％。
14、优选地，所述明胶溶液的质量百分比浓度为1～30wt％，若浓度太高，明胶溶液的粘度太大，则会导致在后续喷雾时容易形成丝状喷雾，不利于形成颗粒均匀的小液滴；若浓度太低，除了不够经济外，还不利于形成稳定的凝聚体，导致最后制备的载体结构稳定性不足。
15、优选地，步骤s2中，所述喷雾温度为30～100℃，所述喷雾方式为气动喷雾，喷雾流量0.1～5l/min，气动压力0.1～2.0mpa，气动介质为空气、氮气、二氧化碳中的任一种；所述明胶微球形成的喷雾液滴粒径为100～500μm。
16、优选地，喷雾后，一次冷冻方式有多种，可以以液氮或者低温冷空气作为速冻剂，进一步优选低温冷空气作为速冻剂。一般将明胶喷雾形成的小液滴与充分预冷的冷空气流进行混合可以将明胶雾滴快速冻结，冷空气流的温度会决定液滴的冻结时间和冰晶形成的大小。冷空气流温度较高会导致液滴来不及完全冻结就被接收器接收，会导致液滴聚团或冰晶形成不均匀影响载体的品质。为了使液滴快速冻结可以将冷空气预冷到较低的温度，为了保证大的液滴也能完全冻结，一般需要低温冷空气的温度为-40℃以下，优选为-80～-40℃。
17、优选地，步骤s3中，所述将一次冷冻后得到的明胶微球加入纯净水中进行化冰与分散，具体步骤为：先加热冻结状态的明胶冰冻微球至-10～-15℃，然后加入2～15℃的纯净水中，快速搅拌使明胶微球快速化冰，并重新分散纯净水中；其中，所述明胶冰冻微球与纯净水的体积比为1：20～1。若纯净水的水温过低(低于2℃)，会导致明胶冰冻微球融化较慢，或者在加入明胶冰冻微球时溶液发生部分结冰。正常情况下明胶冰冻微球在水溶液中会快速化冰，但化冰后由于明胶的凝胶化已经发生微球并不会溶解，所以此时在水溶液中形成的是分散的明胶凝胶微球。若水温过高(高于15℃)，明胶冰冻微球有溶解的风险，故纯净水的水温不宜过高。
18、优选地，步骤s4中，所述纯净水的温度为0～15℃。
19、优选地，所述二次冷冻的方式可以为以下四种中的任意一种：(1)将加入交联剂的微球溶液倒入托盘中，放置在低温冰箱中进行冷冻，低温冰箱的温度设定在-40℃以下；(2)将-20℃以下冷风通过高速风机吹过盛有明胶溶液的托盘，利用低温空气强制对流的方式冻结明胶微球溶液；(3)将明胶溶液装入导热较好的圆柱(直径≤5cm)或扁平容器(短边≤4cm)中并将容器浸没在-10℃以下的冷冻液中冻结明胶微球；(4)利用液氮速冻柜冻结明胶微球溶液，冻结温度-20℃～-150℃。
20、优选地，步骤s4中，所述交联固化的温度为-40℃～-5℃，所述交联剂为戊二醛、乙二醛、甲醛、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、1,6-己二异氰酸酯、丁二烯二环氧化物、顺丁烯二酸酐本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，在配制明胶溶液的过程中加入了pH调节剂，以调节明胶溶液为中性，所述pH调节剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸中的一种或者两种以上的组合。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，在配制明胶溶液的过程中还加入了晶型生长控制剂，所述晶型生长控制剂的加入量为明胶溶液总质量的0～1wt％；所述晶型生长控制剂为氯化钠、氯化钙、氯化钾、二甲基亚砜、甘油中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液的质量百分比浓度为1～30wt％。
5.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述喷雾温度为30～100℃，所述喷雾方式为气动喷雾，喷雾流量0.1～5L/min，气动压力0.1～2.0Mpa，气动介质为空气、氮气、二氧化碳中的任一种；所述明胶
6.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述将一次冷冻后得到的明胶冰冻微球加入纯净水中进行化冰与分散，具体步骤为：先加热冻结状态的明胶微球至-10～-15℃，然后加入2～15℃的纯净水中，快速搅拌使明胶微球快速化冰，并重新分散纯净水中；其中，所述明胶冰冻微球与纯净水的体积比为1：20～1。
7.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述纯净水的温度为0～15℃。
8.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述二次冷冻的方式为以下四种中的任意一种：(1)将加入交联剂的微球溶液倒入托盘中，放置在低温冰箱中进行冷冻，低温冰箱的温度设定在-40℃以下；(2)将-20℃以下冷风通过高速风机吹过盛有明胶溶液的托盘，利用低温空气强制对流的方式冻结明胶微球溶液；(3)将明胶溶液装入直径≤5cm的圆柱或短边≤4cm的扁平容器中并将容器浸没在-10℃以下的冷冻液中冻结明胶微球；(4)利用液氮速冻柜冻结明胶微球溶液，冻结温度-20℃～-150℃。
9.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述交联固化的温度为-40℃～-5℃，所述交联剂为戊二醛、乙二醛、甲醛、1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、1,6-己二异氰酸酯、丁二烯二环氧化物、顺丁烯二酸酐、多巴胺盐酸盐、京尼平中的一种或者两种以上的组合。
10.一种如权利要求1-9任一项所述制备方法制得的用于细胞培养的明胶微载体。
...【技术特征摘要】
1.一种用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤s1中，在配制明胶溶液的过程中加入了ph调节剂，以调节明胶溶液为中性，所述ph调节剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸中的一种或者两种以上的组合。
3.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤s1中，在配制明胶溶液的过程中还加入了晶型生长控制剂，所述晶型生长控制剂的加入量为明胶溶液总质量的0～1wt％；所述晶型生长控制剂为氯化钠、氯化钙、氯化钾、二甲基亚砜、甘油中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液的质量百分比浓度为1～30wt％。
5.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述喷雾温度为30～100℃，所述喷雾方式为气动喷雾，喷雾流量0.1～5l/min，气动压力0.1～2.0mpa，气动介质为空气、氮气、二氧化碳中的任一种；所述明胶微球形成的喷雾液滴粒径为100～500μm；所述一次冷冻方式以液氮或者低温冷空气作为速冻剂，所述低温冷空气的温度为-80～-40℃。
6.根据权利要求1所述的用于细胞培养的明胶微载体的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述将一次冷冻后得到的明胶冰冻微球加入纯净水中进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：王进产，杨梦梦，康笃利，
申请(专利权)人：洛阳赛奥生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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