【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及液相色谱-质谱法或液相色谱法检测rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法。
技术介绍
1、假尿嘧啶被称为rna中第5个碱基，是rna中最丰富的修饰，广泛存在于trna，rrna，snrna和mrna中。ψ的高通量测序方法是依赖n-环己基-n’-β-乙基碳二亚胺(cmc)，例如，ψ-seq，pseudo-seq，psi-seq和ceu–seq。此外，亚硫酸盐使得含有ψ位点的核苷酸形成单二亚硫酸盐，这导致在反转录过程中该位点不能不发生反转录。因此，利用亚硫酸盐处理，开发了rbs-seq来检测ψ修饰，但是该方法无法检测到trna中的ψ的位点。近期，结合cmc和去甲基化酶处理，dm-ψ-seq被开发出来检测trna中的ψ修饰位点。
2、n1-甲基-假尿苷修饰(m1ψ，cas号13860-38-3)是一种甲基假尿甘，与ψ不同的是m1ψ在n1位置对ψ进行了甲基化。m1ψ修饰被发现富集在trna和rrna中。m1ψ同样也可以与a进行配对，且有着比ψ更高的亲和力。目前已知m1ψ可以有效的促进mrna翻译并且可以延长mrna的半衰期。m1ψ修饰可以更好的稳定cds序列中的二级结构。
3、此外，m1ψ修饰作为有效稳定mrna半衰期的重要修饰，被应用于mrna疫苗中。katalin karikó和drew weissman在针对mrna疫苗中加入m1ψ等重要核苷酸修饰，并因此获得2023年诺贝尔生理学或医学奖。未改造的mrna疫苗容易引发体内免疫原性，利用带有m1ψ修饰的rna疫苗将抗原转移到小鼠靶细胞中，可以有
4、值得一提的是m1ψ修饰在植物中未有报道，作为稳定mrna半衰期和提高mrna翻译效率的重要修饰，其在植物中的研究和应用仍是空白。利用m1ψ修饰可以有效提高rna疫苗效价，利用m1ψ修饰开发植物rna纳米疫苗具有广阔的前景。解析m1ψ修饰影响植物rna稳定性的分子机制有助于表观遗传育种，这在作物遗传改良方面有着巨大的潜力。因此，开发一种精准测量植物体内m1ψ修饰含量可以极大的推动表观遗传育种的发展。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的一个技术问题是如何检测rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种通过lc-ms检测rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：
3、s1、提取生物样本的rna，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；
4、s2、进行液相色谱-质谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的n1-甲基-假尿苷含量和尿嘧啶核糖核苷含量分别进行定量，以n1-甲基-假尿苷含量除以尿嘧啶核糖核苷含量，获得所述生物样本的rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度；
5、所述n1-甲基-假尿苷含量根据在碰撞能量为5v，m/z为259.2-223的离子峰、碰撞能量为10v，m/z为259.2-138.9的离子峰和碰撞能量为25v，m/z为259.2-95.9的离子峰对应的色谱峰进行定量；
6、所述尿嘧啶核糖核苷含量根据在碰撞能量为35v，m/z为245.1-69.9的离子峰对应的色谱峰进行定量。
7、上述方法中，所述液相色谱-质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液(溶剂为水，溶质为甲酸)，b相为甲酸体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液(溶剂为乙腈，溶质为甲酸)；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到8min，a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于8min到10min，a相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于10min到15min，a相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于15min到20min，a相占流动相的体积份数由0％线性上升至100％。
8、上述方法中，所述液相色谱采用的色谱柱为thermo scientific hypersil goldaq reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述n1-甲基-假尿苷的色谱峰的保留时间为3.2±1min分钟；所述尿嘧啶核糖核苷的色谱峰的保留时间为2.1±1min分钟。
9、上述方法中，所述单核苷酸制备在反应体系中进行，所述反应体系为由下述物质组成的液体：rna、腺苷脱氨酶抑制、四氢尿苷、抗氧化剂、2，6-二叔丁基对甲基苯酚、核酸酶p1、磷酸二酯酶i、乙酸钠、zncl2和水；所述rna的含量为500ng/300μl、腺苷脱氨酶抑制的含量为0.005μg/μl、四氢尿苷的含量为0.05μg/μl、抗氧化剂的含量为0.1mm、2，6-二叔丁基对甲基苯酚的含量为0.1mm、核酸酶p1的含量为1u、磷酸二酯酶i的含量为0.01u、乙酸钠的含量为0.1mm、zncl2的含量为0.0067mm，余量为水。
10、上述方法中，所述单核苷酸制备在37℃进行3小时。
11、上述方法中，所述去磷酸化利用碱性磷酸酶进行。
12、上述方法中，所述去磷酸化在37℃进行30分钟。
13、上述方法中，所述纯化单核苷酸采用截留分子量为10kda的超滤管进行。
14、本专利技术还提供上述液相色谱-质谱法检测rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法在对生物样本中的n1-甲基-假尿苷核苷酸和/或尿嘧啶核糖核苷进行定量中的应用。
15、所述应用具体可为液相色谱-质谱法检测rna中n1-甲基-假尿苷核苷酸含量和/或尿嘧啶核糖核苷含量的方法，所述方法包括上述的s1和s2，所述方法还包括s3：利用标准曲线对生物样本的n1-甲基-假尿苷核苷酸和/或尿嘧啶核糖核苷进行定量的步骤。
16、本专利技术还提供液相色谱法检测rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法，包括如下步骤：
17、z1、提取生物样本的rna，进行单核苷酸制备，进一步去磷酸化，然后纯化单核苷酸，得到上机样本；
18、z2、进行液相色谱法检测，采用外标法对所述上机样本中的n1-甲基-假尿苷含量和尿嘧啶核糖核苷含量分别进行定量，以n1-甲基-假尿苷含量除以尿嘧啶核糖核苷含量，获得所述生物样本的rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度；液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，b相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到8min，a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于8min到10min，a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.液相色谱-质谱法检测RNA中N1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由A相和B相组成，所述A相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，B相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到8min，A相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于8min到10min，A相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于10min到15min，A相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于15min到20min，A相占流动相的体积份数由0％线性上升至100％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱采用的色谱柱为ThermoScientific Hypersil GOLD aQ reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述N1-甲基-假尿苷的色谱峰的保留时间
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述单核苷酸制备在反应体系中进行，所述反应体系为由下述物质组成的液体：RNA、腺苷脱氨酶抑制、四氢尿苷、抗氧化剂、2，6-二叔丁基对甲基苯酚、核酸酶P1、磷酸二酯酶I、乙酸钠、ZnCl2和水；所述RNA的含量为500ng/300μl、腺苷脱氨酶抑制的含量为0.005μg/μl、四氢尿苷的含量为0.05μg/μl、抗氧化剂的含量为0.1mM、2，6-二叔丁基对甲基苯酚的含量为0.1mM、核酸酶P1的含量为1U、磷酸二酯酶I的含量为0.01U、乙酸钠的含量为0.1mM、ZnCl2的含量为0.0067mM，余量为水。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述去磷酸化利用碱性磷酸酶进行。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述纯化单核苷酸采用截留分子量为10kDa的超滤管进行。
7.权利要求1-6中任一所述的方法在对生物样本中的N1-甲基-假尿苷酸和/或尿嘧啶核糖核苷进行定量中的应用。
8.液相色谱法检测RNA中N1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述液相色谱采用的色谱柱为ThermoScientific Hypersil GOLD aQ reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述N1-甲基-假尿苷的色谱峰的保留时间为3.2±1min分钟；所述尿嘧啶核糖核苷的色谱峰的保留时间为2.1±1min分钟。
10.权利要求8-9中任一所述的方法在对生物样本中的N1-甲基-假尿苷酸和/或尿嘧啶核糖核苷进行定量中的应用。
...【技术特征摘要】
1.液相色谱-质谱法检测rna中n1-甲基-假尿苷修饰丰度的方法，其特征在于：包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱法检测中，液相色谱采用的流动相由a相和b相组成，所述a相为甲酸体积百分含量为0.1％的甲酸水溶液，b相为体积百分含量为0.1％甲酸的乙腈溶液；液相色谱采用的洗脱程序如下：从0min到8min，a相占流动相的体积比由100％线性下降至99％；从大于8min到10min，a相占流动相的体积比由小于99％线性下降至94％；从大于10min到15min，a相占流动相的体积比由小于94％线性下降至0％；从大于15min到20min，a相占流动相的体积份数由0％线性上升至100％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱采用的色谱柱为thermoscientific hypersil gold aq reverse phase column，柱长为100mm，柱内径为2.1mm,填料的粒径为1.9um；所述色谱柱的柱温为25℃，流动相的流速为0.3ml/min；所述n1-甲基-假尿苷的色谱峰的保留时间为3.2±1min分钟；所述尿嘧啶核糖核苷的色谱峰的保留时间为2.1±1min分钟。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述单核苷酸制备在反应体系中进行，所述反应体系为由下述物质组成的液体：rna、腺苷脱氨酶抑制、四氢尿苷、抗氧化剂、2，6-二叔丁基对甲基苯酚、核酸酶p1、磷酸二酯酶i、乙酸钠、zncl2和...
【专利技术属性】
技术研发人员：普莉，张道磊，乐亮，徐帆，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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