【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，尤其是一种产镰孢菌酸的重组酿酒酵母菌、方法与应用。
技术介绍
1、镰孢菌酸(fusaricacid,fa)又称为5-丁基吡啶羧酸，是镰刀菌(fusariummoniliforme)、氧孢镰刀菌(fusarium oxysporum)和异孢镰刀菌(fusariumheterosporum)产生的一种次级代谢产物。抑菌实验发现fa对多种植物致病真菌表现出显著的抑制作用，如稻瘟病菌、稻曲病菌、大丽轮枝菌等，对植物生长起到保护作用。另外，fa是哺乳动物多巴胺β-羟化酶的非竞争性抑制剂，因此可用于提高中枢神经系统中多巴胺的水平，从而达到治疗抑郁症、帕金森病、注意力缺陷多动障碍等疾病。因此，fa在植物保护和医药健康领域具有重要的应用前景。
2、fa是多种镰刀菌属真菌的次级代谢产物。目前报道的镰孢菌酸的合成方式主要是生物化学合成法。比如通过水解镰孢菌酸叔丁酯或者镰孢菌酸甲酯生成镰孢菌酸；以2-氰基-5-甲基吡啶为底物，通过多步水解获得镰孢菌酸；以2-甲基吡啶为底物，经多步氧化还原和水解反应,合成镰孢菌酸等。然而这些合成方式存在底物成本高、反应步骤繁琐、产率低等问题，难以满足工业规模生产的需要。微生物发酵法为镰孢菌酸的高效、绿色制造提供了解决方案。
3、虽然fa在植物病理学、真菌学和食品安全方面研究颇多，然而fa生物合成途径及调控网络尚不清楚。目前发现在多种镰刀菌中发现保守的fa生物合成基因簇，整个基因簇包含15个基因，其中与fa合成直接相关的有12个基因(fub1-fub12)，然而与fa合成相
4、酿酒酵母安全无毒，遗传背景清晰，遗传操作容易，培养简单，具有较高的流体静压耐受性，适合大规模生产。随着合成生物学技术的发展，酿酒酵母被用来合成多种化学品。目前已经报道，酿酒酵母被用于合成青蒿素、萜类化合物、有机酸等。
5、目前尚未见有关以酿酒酵母为底盘细胞进行镰孢菌酸的代谢工程改造研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种产镰孢菌酸的重组酿酒酵母菌、方法与应用。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种产镰孢菌酸的重组酿酒酵母菌，所述重组酿酒酵母菌是以酿酒酵母胞内丙二酰辅酶a为出发化合物，通过表达高度还原聚酮合酶fub1、丝氨酸水解酶fub4、中链脱氢酶/还原酶fub6，o-乙酰基-l-同型丝氨酸硫化氢解酶fub7，nrps样羧酸还原酶fub8组成的(2s)-2-氨基-5-甲酰基壬酸模块，fmn依赖的羟酸氧化酶fub9和fa转运蛋白fub11，得到重组酿酒酵母菌株。
4、进一步地，所述酿酒酵母宿主为saccharomyces cerevisiae by4741(mata,his3δ1,leu2δ0,met15δ0,ura3δ0)。
5、进一步地，编码所述途径的基因来源于水稻恶苗病菌，包括核苷酸序列如seq idno.1所示的高度还原聚酮合酶编码基因fffub1，核苷酸序列如seq id no.2所示的丝氨酸水解酶编码基因fffub4，核苷酸序列如seq id no.3所示的中链脱氢酶/还原酶编码基因fffub6，核苷酸序列如seq id no.4所示的o-乙酰基-l-同型丝氨酸硫化氢解酶编码基因fffub7，核苷酸序列如seq id no.5所示的nrps样羧酸还原酶编码基因fffub8，核苷酸序列如seq id no.6所示的fmn依赖的羟酸氧化酶编码基因fffub9，以及核苷酸序列如seq idno.7所示的fa转运蛋白编码基因fffub11。
6、如上所述的重组酿酒酵母菌的构建方法，包括如下步骤：
7、构建由核苷酸序列如seq id no.8所示的ppgk1的介导高度还原聚酮合酶的基因fffub1表达盒和核苷酸序列如seq id no.12所示的his3营养缺陷筛选标记基因表达盒，通过adh1基因的上游同源臂核苷酸序列如seq id no.10所示的adh1-up和核苷酸序列如seqid no.11所示的adh1基因的下游同源臂adh1-down，整合插入adh1基因位点；构建分别由核苷酸序列如seq id no.13所示的ptef1和核苷酸序列如seq id no.15所示的ptrp1介导的丝氨酸水解酶的基因fffub4和编码o-乙酰基-l-同型丝氨酸硫化氢解酶fffub7表达盒，以及核苷酸序列如seq id no.31所示的leu2营养缺陷筛选标记基因表达盒，通过核苷酸序列如seq id no.16所示的rnd18-1基因的上游同源臂rdn18-1-up和核苷酸序列如seq id no.17所示的rnd18-1基因的下游同源臂rdn18-1-down，整合插入rnd18-1基因位点；构建分别由核苷酸序列如seq id no.18所示的pgap和核苷酸序列如seq id no.19所示的picl1介导的中链脱氢酶/还原酶fffub6和nrps样羧酸还原酶fffub8表达盒，以及核苷酸序列如seq idno.21所示的met15营养缺陷筛选标记基因表达盒，通过核苷酸序列如seq id no.22所示的gal1基因的上游同源臂gal1-up和核苷酸序列如seq id no.23所示的gal1基因的下游同源臂gal1-down，整合插入gal1基因位点；构建分别由核苷酸序列如seq id no.24所示的ptpi1和核苷酸序列如seq id no.26所示的peno1介导的fmn依赖的羟酸氧化酶编码基因fffub9和fa转运蛋白编码基因fffub11表达盒，以及核苷酸序列如seq id no.30所示的kanmx抗性筛选标记基因表达盒，通过核苷酸序列如seq id no.28所示的trp1基因的上游同源臂trp1-up和核苷酸序列如seq id no.29所示的trp1基因的下游同源臂trp1-down，整合插入trp1基因位点。
8、利用如上所述的重组酿酒酵母菌发酵产镰孢菌酸的方法，包括如下步骤：
9、将重组酿酒酵母菌接种于ypd液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养18-20h，获得种子液；使用紫外分光光度计测种子液的od600，然后将种子液按接种量1％转接于发酵培养基中，使发酵初始od600为0.1，在28℃-30℃，220rpm摇床中培养4天，收获含有产镰孢菌酸发酵液。
10、进一步地，所述ypd液体培养基的组成为：葡萄糖2.0％，酵母浸粉1.0％，蛋白胨2.0％，115℃灭菌20min；
11、其中，所述百分数均为质量百分数。
12、进一步地，所述发酵培养基是以蔗糖或葡萄糖作为碳源的无机盐培养基，其配方为：葡萄糖2.5％，硫酸铵1.5％，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产镰孢菌酸的重组酿酒酵母菌，其特征在于：所述重组酿酒酵母菌是以酿酒酵母胞内丙二酰辅酶A为出发化合物，通过表达高度还原聚酮合酶FUB1、丝氨酸水解酶FUB4、中链脱氢酶/还原酶FUB6，O-乙酰基-L-同型丝氨酸硫化氢解酶FUB7，NRPS样羧酸还原酶FUB8组成的(2S)-2-氨基-5-甲酰基壬酸模块，FMN依赖的羟酸氧化酶FUB9和FA转运蛋白FUB11，得到重组酿酒酵母菌株。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于：所述酿酒酵母宿主为Saccharomyces cerevisiae BY4741(MATa,his3Δ1,leu2Δ0,met15Δ0,ura3Δ0)。
3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于：编码所述途径的基因来源于水稻恶苗病菌，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的高度还原聚酮合酶编码基因ffFUB1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的丝氨酸水解酶编码基因ffFUB4，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的中链脱氢酶/还原酶编码基因ffFUB6，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的O
4.如权利要求1至3任一项所述的重组酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
5.利用如权利要求1至3任一项所述的重组酿酒酵母菌发酵产镰孢菌酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述YPD液体培养基的组成为：葡萄糖2.0％，酵母浸粉1.0％，蛋白胨2.0％，115℃灭菌20min；
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基是以蔗糖或葡萄糖作为碳源的无机盐培养基，其配方为：葡萄糖2.5％，硫酸铵1.5％，磷酸二氢钾0.8％，硫酸镁0.3％，氯化钙0.01％，七水硫酸锌0.08％，115℃灭菌20min；冷却后，加入1％微量元素溶液，1.2％复合维生素溶液；
8.如权利要求1至3任一项所述的重组酿酒酵母菌在发酵产镰孢菌酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述镰孢菌酸用于医药或植物保护中。
...【技术特征摘要】
1.一种产镰孢菌酸的重组酿酒酵母菌，其特征在于：所述重组酿酒酵母菌是以酿酒酵母胞内丙二酰辅酶a为出发化合物，通过表达高度还原聚酮合酶fub1、丝氨酸水解酶fub4、中链脱氢酶/还原酶fub6，o-乙酰基-l-同型丝氨酸硫化氢解酶fub7，nrps样羧酸还原酶fub8组成的(2s)-2-氨基-5-甲酰基壬酸模块，fmn依赖的羟酸氧化酶fub9和fa转运蛋白fub11，得到重组酿酒酵母菌株。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于：所述酿酒酵母宿主为saccharomyces cerevisiae by4741(mata,his3δ1,leu2δ0,met15δ0,ura3δ0)。
3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于：编码所述途径的基因来源于水稻恶苗病菌，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的高度还原聚酮合酶编码基因fffub1，核苷酸序列如seq id no.2所示的丝氨酸水解酶编码基因fffub4，核苷酸序列如seq id no.3所示的中链脱氢酶/还原酶编码基因fffub6，核苷酸序列如seq id no.4所示的o-乙酰基-l-同型丝氨酸硫化氢解酶编码基因fffub7，核苷酸序列如seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹威，梁敏仪，赵宇欣，高莹，谭宇洋，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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