【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞外囊泡分离。具体地说是基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法。
技术介绍
1、细胞通过分泌信号分子(包括蛋白质、脂质和核酸等)与彼此进行沟通。为了避免快速降解和免受免疫监视等目的，细胞可以将这些信号分子封装到细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)中，从而实现局部和远距离的细胞间通讯。evs是一组由各种细胞分泌的纳米级脂质双层结构的囊泡，被脂双层膜包裹，细胞外囊泡(evs)是由细胞主动分泌并释放到细胞外环境的纳米级脂质双层膜性结构，直径在30-1000nm，根据囊泡直径大小可分为外泌体、微囊泡或凋亡小体。
2、目前已证实在正常和病理条件下所有类型的细胞都会释放evs，并可在所有组织和体液中检测到，近年来分离和分析方法的不断进步，使得越来越多的ev类型被确定出来。evs起源于细胞内的多细胞外囊泡体(mvbs)，mvbs是由内吞作用产生的，在此过程中，多种机制介导质膜向内出芽和早期内体的形成。研究细胞外囊泡的意义在于深入理解细胞间通讯、诊断疾病、发现新的治疗靶点、开发药物递送系统以及推动生物工程和纳米技术的发展。这一领域的研究将为未来的生命科学和医学研究带来新的突破和进展。
3、细胞外囊泡的分离纯化是evs相关基础研究和临床应用的瓶颈问题之一，其主要原因是evs的大小和理化性质与脂蛋白、蛋白质复合体和乳糜颗粒等均有不同程度的重叠。现有技术中的细胞外囊泡最常用的分离方法是超高速离心或者是密度梯度离心法，然而这些方法需要配备各种的超高速高心机，而这种设备以及配套的
技术实现思路
1、为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，采用多跨膜蛋白抗体免疫吸附式分离方式，针对细胞外囊泡质膜嵌合的四聚体为靶点，能特异性富集生物样品中表达某种或某几种特异性嵌合蛋白的细胞外囊泡。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
3、基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，包括如下步骤：
4、s1、制备预处理样品溶液，将收集的样品离心过滤后用1×平衡缓冲液稀释，得到预处理样品溶液；
5、s2、制备免疫吸附柱，向活化后的吸附柱内加入配制的偶联剂工作液，洗涤后获得免疫吸附柱；
6、s3、将预处理样品溶液添加至免疫吸附柱内，使预处理样品溶液自然流过免疫吸附柱；
7、s4、向s3中的免疫吸附柱内加入1×平衡缓冲液洗去非特异性结合；
8、s5、向s4中免疫吸附柱内加入配制的洗脱工作液对样品溶液中的细胞外囊泡进行洗脱，得到纯化的细胞外囊泡。
9、更进一步地，所述样品采用细胞培养上清液、血浆、体液中任一种；
10、所述平衡缓冲液中包括40-100mm tris-hac、0-150mm nacl和1％-8％ bsa，且所述平衡缓冲液的ph为7-9；
11、所述洗脱工作液采用将500μl洗脱缓冲液溶解于20ml 1×平衡缓冲液中制成，所述洗脱缓冲液包括40-100mm naac-hac，所述洗脱工作液的ph为3-4。
12、更进一步地，所述平衡缓冲液包括50mm tris-hac、150mm nacl和5％bsa，所述平衡缓冲液的ph为7.4；
13、所述洗脱缓冲液包括50mm naac-hac，所述洗脱工作液的ph为3.5。
14、更进一步地，步骤s1中，离心后样品的过滤步骤如下：
15、a1、将收集的样品于300-2000g条件下离心15min，将上清液转移到离心管中；
16、a2、将样品上清液流过具有0.45μm膜包的切向流夹具获得第一流出液；
17、a3、将切向流夹具上的0.45μm膜包更换为300kd膜包，将第一流出液流过300kd膜包进行过滤、浓缩后收集样品浓缩液；
18、a4、用1×平衡缓冲液按照1:3的比例稀释样品浓缩液得到预处理样品溶液。
19、更进一步地，步骤s1中，离心后样品在过滤前经杂蛋白去除处理，用akta pure 25蛋白纯化系统和mabselect prism a柱将样品溶液中的杂蛋白洗脱后通过切向流过滤浓缩以分离、浓缩细胞外囊泡。
20、更进一步地，步骤s2中，免疫吸附柱的制备包括如下步骤：
21、b1、用剪刀剪掉吸附柱的下端，揭开吸附柱上端的帽子，向吸附柱内加入5ml的1×的平衡缓冲液使其自然流入废液瓶中，对吸附柱进行活化；
22、b2、向吸附柱内加入1ml偶联剂工作液，盖上帽子，使其反应5min后经重力自然流出；
23、b3、用5ml的1×平衡缓冲液洗涤吸附柱，洗去吸附柱内未结合的抗体偶联剂，获得免疫吸附柱。
24、更进一步地，步骤s2中所述的偶联剂工作液采用1×平衡缓冲液溶解抗体偶联剂形成抗体偶联剂储备液，取抗体偶联剂储备液200μl加入800μl的1×的平衡缓冲液进行稀释，获得偶联剂工作液。
25、更进一步地，所述抗体偶联剂采用四次跨膜蛋白抗体，所述四次跨膜蛋白抗体包括cd81、cd63、cd9、cd36、cd82中任一种或几种。
26、更进一步地，步骤s5中，洗脱工作液的加入量为2ml，洗脱工作液加入免疫吸附柱内后，盖上帽子使其反应2min，然后自然流过免疫吸附柱，样品溶液中的目标细胞外囊泡从免疫吸附柱上释放并形成沉淀，以获得纯化的细胞外囊泡。
27、本专利技术的技术方案取得了如下有益的技术效果：
28、1、本专利技术基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，采用多跨膜蛋白抗体免疫吸附式分离方式，针对细胞外囊泡质膜嵌合的四聚体为靶点，借助免疫反应实现对外囊泡的捕获与定量，能特异性富集生物样品中表达某种或某几种特异性嵌合蛋白的细胞外囊泡。
29、2、本专利技术基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，不需要昂贵的设备，设施投入较少，分离纯度高，杂质少，一致性高，并且不受类似物如脂蛋白、乳糜颗粒等的干扰，最终的浓度较高，能够满足后续试验的需求。
30、3、本专利技术基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，采用蛋白洗脱系统和mabselect prism a柱可洗脱样品溶液中大量的杂蛋白残留，通过切向流在去除较大杂蛋白和囊泡的同时浓缩样品溶液，可避免样品溶液体积的增大，无需使用高端复杂的仪器，便于执行。
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1.基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，所述样品采用细胞培养上清液、血清、血浆、体液中任一种；
3.根据权利要求2所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，所述平衡缓冲液包括50mM Tris-HAc、150mM NaCl和5％BSA，所述平衡缓冲液的pH为7.4；
4.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，步骤S1中，离心后样品的过滤步骤如下：
5.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，步骤S2中，免疫吸附柱的制备包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，步骤S2中所述的偶联剂工作液采用1×平衡缓冲液溶解抗体偶联剂形成抗体偶联剂储备液，取抗体偶联剂储备液200μL加入800μL的1×的平衡缓冲液进行稀释，获得偶联剂工作液。
7.根据权
8.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，步骤S5中，洗脱工作液的加入量为2mL，洗脱工作液加入免疫吸附柱内后，盖上帽子使其反应2min，然后自然流过免疫吸附柱，样品溶液中的目标细胞外囊泡从免疫吸附柱上释放并形成沉淀，以获得纯化的细胞外囊泡。
...【技术特征摘要】
1.基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，所述样品采用细胞培养上清液、血清、血浆、体液中任一种；
3.根据权利要求2所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，所述平衡缓冲液包括50mm tris-hac、150mm nacl和5％bsa，所述平衡缓冲液的ph为7.4；
4.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，步骤s1中，离心后样品的过滤步骤如下：
5.根据权利要求1所述的基于四次跨膜蛋白免疫吸附的细胞外囊泡分离方法，其特征在于，步骤s2中，免疫吸附柱的制备包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵礼军，熊建民，李静静，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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