【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药用植物生物，更具体地说，涉及一种基于高含量人参皂苷提高稀有皂苷转化率的方法。
技术介绍
1、人参(panax ginseng c.a.meyer)为五加科人参属多年生草本植物，在中国主要分布于黑龙江、吉林和辽宁等地，一般生长于海拔较高的针叶林和阔叶林下，砂质土壤，喜爱散射光。人参作为中国传统珍稀药材，被公认为“百草之王”，以根入药，有强效滋补及调节血压作用，其主要活性成分为人参皂苷，具有抑菌、抗炎、抗肿瘤和抗氧化等生理活性，目前栽培人参有三种方式，包含伐林栽参、林下栽参和大田栽参，栽培方式不同，人参的品质也不尽相同。但这些方法存在参地限制及管理成本较高、“重毒副”残留等问题，且人参皂苷含量稍低。
2、随着“大健康产业”的快速发展，对人参原材料的需求急剧增加，小规模生产远远不能满足市场日益增加的需求，研究发现，利用植物细胞和器官的离体培养物可以作为生产天然产物的原材料，因此，通过植物细胞工程技术培育的人参不定根有望成为解决人参资源短缺的手段，人参不定根培养耗时短、成本低，皂苷含量虽然有所提高，但是稀有皂苷的含量极低，限制了其开发利用。稀有人参皂苷相较于人参皂苷具有更高好的生物活性，也更有利于身体吸收，随着生物技术的发展，生物转化法合成稀有人参皂苷成为了本领域的研究热点。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种提高人参不定根中皂苷含量和稀有皂苷转化率的方法，旨在解决人参不定根培养过程中提高皂苷含量和稀有皂苷转化率的问题，通过金属螯合物与桦褐孔菌联合
2、本专利技术公开了一种基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，包括如下步骤：(1)菌种的采集、分离纯化、鉴定、诱变与筛选；(2)螯合物(gly-ge)的制备；(3)人参不定根的诱导、增殖和放大培养；(4)提高人参不定根中皂苷的含量及转化率；本专利技术采用紫外线诱变桦褐孔菌菌丝体，使其产生遗传变异，从而筛选出产β-葡萄糖苷酶的优质菌株作为诱导子，用于后续研究；ge是具有高度生物活性的微量元素，广泛分布在植物体内，将金属ge和gly反应形成金属螯合物，由于其有化学结构稳定，吸收利用率高的优势，使其快速被人参不定根吸收，进而使得皂苷含量明显提高，同时加入药用真菌桦褐孔菌，产生β-葡萄糖苷酶，调节ph值，改变细胞通透性，促使大量皂苷转化为稀有皂苷。本专利技术通过利用植物细胞工程技术，建立简便、快捷、安全可靠的人参稀有皂苷生产体系，在此条件下，rg1+re总含量为rg1+re总含量12.76±0.03mg/g、rb1含量为24.83±0.04mg/g、总皂苷含量为176.71±3.78mg/g，其中，rg1+re总含量，rb1含量相比于《药典》对人参规定值0.30％和0.20％分别提高了3.25倍和11.42倍，人参皂苷rb1、rd生产人参稀有皂苷f2、ck、rg3的转化率可达37.60％。
3、为了实现上述目的，本专利技术提供了一种基于高含量人参皂苷提高稀有皂苷转化率的方法，包括如下步骤：
4、s1、预处理：选取新鲜的桦褐孔菌子实体，去除表面杂质，依次用清水、酒精冲洗；
5、s2、桦褐孔菌的分离纯化、诱变和筛选，包括如下步骤：
6、sa1、分离纯化：无菌条件下，切取桦褐孔菌子实体的菌核组织块接入分离培养基进行分离培养，分离培养后挑选菌落边缘转移至pda加富培养基进行纯化培养，纯化培养后再挑选菌丝生长粗壮旺盛的菌丝体接种于pda斜面培养基进行避光培养，得到菌种菌丝体；所述分离培养基为添加桦树皮粉末10～15g/l、琼脂15～18g/l、其余为水的固体培养基；所述pda斜面培养基为添加马铃薯8～12g/l、葡萄糖10～15g/l、魔芋粉4～8g/l、其余为水的固体培养基；所述pda加富培养基为在pda斜面培养基中添加3～4g/l魔芋粉的固体培养基；
7、sa2、诱变：将步骤sa1纯化后的菌落转接至pda液体培养基中摇床培养后摇碎菌丝，再经过灭菌脱脂棉过滤，得到菌丝悬液；将经生理盐水稀释的菌丝悬液涂抹在装有15～20ml pda培养基的平板上进行光照培养；所述pda液体培养基为添加马铃薯8～12g/l、葡萄糖10～15g/l、其余为水的液体培养基；所述pda培养基为添加马铃薯8～12g/l、葡萄糖10～15g/l、魔芋粉4～8g/l、其余为水的固体培养基；
8、sa3、筛选：光照培养后，黑暗条件下对平板进行恒温培养，恒温培养后挑选菌丝发育良好的菌株接种于pda液体培养基进行摇床培养，培养后再利用10倍稀释法逐级稀释菌液，将稀释后的菌液在筛选培养基上涂布均匀，密封后再进行倒置培养，倒置培养后挑选菌落周围呈红棕色且边缘整齐的单一菌落接种到新的筛选培养基进行倒置培养，重复3～6次密封后的步骤，得到单一菌株桦褐孔菌y104(inonotus obliquus y104)；将平板上的菌丝转移至pda液体培养基进行摇床培养，获得桦褐孔菌y104(inonotus obliquus y104)的菌液培养液，培养条件为温度25～28℃，时间为7～10d，摇床培养的转速为100～120r/min；所述筛选培养基为添加14～16g/l r2a合成培养基、柠檬酸铁0.3～0.6g/l、七叶苷0.8～1.2g/l，其余为水的固体培养基；
9、s3、人参不定根的诱导与增殖：取人参的根部脱毒后切成小段接种至诱导培养基进行诱导培养，将诱导培养得到的人参不定根接种至固体增殖培养基进行继代培养后再转接至液体增殖培养基进行增殖培养，得到液体增殖培养体系；所述诱导培养基为添加1～2mg/l iba、0.5～0.8mg/l naa、0.5％琼脂和3％蔗糖的ms培养基；所述液体增殖培养基为添加4～6mg/l iba、0.3～0.6mg/l naa、3％蔗糖的ms培养基；所述固体增殖培养基为液体增殖培养基中添加0.5％琼脂；
10、s4、人参不定根的生物反应器培养：将步骤s4所述液体增殖培养体系转移至生物反应器中进行培养，得到人参不定根；
11、s5、gly-ge培养基培养：将步骤s5得到的人参不定根转接至gly-ge培养基中，并再次置于生物反应器进行第一阶段培养，第一阶段培养后，向生物反应器中加入步骤sa3得到的菌液培养液进行第二阶段培养，得到高含量稀有皂苷的人参不定根；所述gly-ge培养基为在去除gly的ms母液培养基中加入0.1～0.3mg/l gly-ge反应液。
12、优选方案下，上述方法有如下特征：
13、(1)步骤s1中，用清水、酒精各冲洗3～5次，所述酒精浓度为70％～80％；
14、(2)步骤sa1所述分离培养条件为在恒温箱中，恒定温度设为25～28℃，时间为7～10d；步骤sa1所述纯化培养条件为温度为25～28℃，时间为8～12d；所述避光培养条件为温度为28～30℃，时间为3～5d；
15、(3)步骤sa2所述摇床培养条件为所述pda液体培养条件为温度25～28℃，摇床培养的转速为100本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，包括如下：
3.根据权利要求2所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，(3)中所述紫外照射光源为紫外灯，所述紫外灯功率为15～25W，照射距离为30～40cm。
4.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，所述分离培养基在使用前加入氨苄青霉素0.3～0.6g/L。
5.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，所述诱导培养基中硫酸亚铁含量低于1.39g/L。
6.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，步骤S4所述脱毒的方法为两步脱毒法，包括如下步骤：将人参根部用浓度为70～80％酒精溶液浸泡25～30s后，用无菌水冲洗3～5次，然后用0.1％的HgCl2溶液浸泡8～12min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％的HgCl2溶
7.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，步骤S5所述Gly-Ge反应液的制备方法包括如下步骤：分别将GeO2和Gly溶于水中，得到0.2g/LGeO2溶液和0.2g/LGly溶液；将Gly溶液在60℃恒温水浴加热搅拌0.5h，并同时使用酸性或碱性调节溶液pH为6～8；再按照体积比为1:1的比例向Gly溶液中滴加GeO2溶液，边加边搅拌，转速为30～60r/min，加热搅拌2h，得到Gly-Ge反应液。
8.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，步骤Sa2利用打孔器将菌落从PDA加富培养基转接至PDA液体培养基；步骤Sa3利用划线法将菌液从PDA液体培养基转移至筛选培养基。
9.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，步骤Sa2所述灭菌脱脂棉的厚度为0.3～0.5mm；所述摇碎菌丝的转速为150～200r/min，时间为30～60min。
10.根据权利要求1～9任一所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，步骤S5所述第二阶段培养添加的菌液培养液的OD600＝0.3～0.6。
...【技术特征摘要】
1.一种基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，包括如下：
3.根据权利要求2所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，(3)中所述紫外照射光源为紫外灯，所述紫外灯功率为15～25w，照射距离为30～40cm。
4.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，所述分离培养基在使用前加入氨苄青霉素0.3～0.6g/l。
5.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，所述诱导培养基中硫酸亚铁含量低于1.39g/l。
6.根据权利要求1所述基于高含量人参皂苷提高人参稀有皂苷转化率的方法，其特征在于，步骤s4所述脱毒的方法为两步脱毒法，包括如下步骤：将人参根部用浓度为70～80％酒精溶液浸泡25～30s后，用无菌水冲洗3～5次，然后用0.1％的hgcl2溶液浸泡8～12min，无菌水冲洗3～5次，再用0.1％的hgcl2溶液浸泡4～7min，无菌水冲洗4～7次。
7.根据权...
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