高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒ｐＥＴＰｃ及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种启动强度高启动速度快宿主范围宽的组成型表达质粒ｐＥＴＰｃ及其在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。本发明专利技术的质粒不但可以组成型启动外源基因的表达，不需要添加任何诱导物也不需要进行任何额外的诱导操作，而且启动强度高，诱导的速度快，表明该质粒在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是基因工程领域表达质粒及应用，尤其是关于高启动强度宽宿主范 围组成型表达质粒PETPc及其在生物降解和生物修复领域的应用。
技术介绍
基因表达系统在生物降解和生物修复领域具有重要作用，是进行外源基因表达的 重要工具。现在常用的基因表达系统，比如tac启动子表达系统、Tn7启动子表达系统以及 一些光照诱导型或者温度诱导型启动子表达系统等，都有一个共同的缺陷，即启动子诱导 表达需要额外添加诱导因子，如IPTG、温度变化、光照变化等。这为生物降解和生物修复带 来了额外的操作，增加了成本，而且，在环境领域应用时增加了表达系统实施的难度，并可 能会给环境带来负面的影响(Di Gennaro et al. ,2008 ；Choi et al.，2005)。因而，有必 要开发新的不受上述限制的组成型表达质粒。芳烃类化合物是一类重要的致癌物质，在环境中广泛存在，不但对环境造成了严 重污染，而且严重威胁人类健康。利用微生物，通过生物降解和生物修复来消除环境污染已 经成为现在重要的研究课题。儿茶酚又称邻苯二酚，是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。 儿茶酚双加氧酶能够作用于芳烃类化合物代谢的中间产物邻苯二酚，它催化苯环的邻位裂 解。这一特性使该酶在芳烃类化合物代谢中处于重要的地位，对消除芳烃类化合物的环境 污染具有重要的意义。参考文献Di Gennaro P,Ferrara S,Bestetti G,et al. Novel auto-inducing expression systems for the development of whole—cell biocatalysts. Appl Microbiol Biotechnol，2008，79 :617_625.Choi K H, Gaynor J B, White K G, et al. (2005)A Tn7_based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods, 2005, 2 :443-448.
技术实现思路
针对现有质粒的缺陷以及现阶段环境污染的现状，本专利技术的目的是提供一种高启 动强度宽宿主范围的组成型表达质粒，并使其应用于在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表 达儿茶酚双加氧酶。本专利技术所述高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒，命名为pETPc，由复制子 Ori1■、筛选标记基因Kan(卡那霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组 成型启动子Pc;其特征在于，所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；其中，所 述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本专利技术所述的质粒pETPc的构建方法是合成启动子Pc，共225bp。以上述合成的Pc片段为模板，设计引物如下3Pc. f (划线部分为 MluI 酶切位点)CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAAPc. r (划线部分为 XbaI 酶切位点)GTCATCTAGAACGGGTTCGCTACCTGC然后配制反应体系ddH2034 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer 5 μ 1, Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ l,Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life.DNA(^^ 启动子 Pc 片段)0. 5 μ 1, Easy Taq 1μ 1。体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下940C 4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，共 29 个循环；最后 72°C IOmin0分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和宽宿主范围表达质粒pET28a(核苷酸序 列如SEQID No.3所示)进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒，命名为 PETPc ；所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。本专利技术所述质粒pETPc在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表达儿茶酚双加氧酶 的应用。其中，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒PETPc启动子Pc后插入儿茶酚双加 氧酶的基因bphC(核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)实现。儿茶酚双加氧酶基因bphC表达的酶为儿茶酚双加氧酶BphC，该酶的特性在于，它 可以迅速的催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛，2-羟基粘糠酸半醛是一种有黄颜 色的化合物，而儿茶酚是无色的。实验中通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等分子操作， 将儿茶酚双加氧酶基因bphC插入到启动子Pc后边，然后将质粒转化不同的菌株，通过向转 化子平板喷涂儿茶酚水溶液，观察转化子的颜色变化来方便的检测转化子是否具有催化化 合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛的能力，从而检测本专利技术质粒是否可以组成型表达以 及质粒的宿主适用范围，并通过儿茶酚双加氧酶活性的测定检测质粒的其它特性。上述质粒pETPc的应用步骤为从假单胞菌P. putida B6-2 (CGMCC No. 3758)中提 取基因组，以此为模板，PCR扩增得到基因bphC，然后分别设计带有不同核酸内切酶酶切位 点的引物，以扩增产物为模板重新进行扩增，然后分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和 质粒pETPc进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒pETPcbphC。以此为 基础，将重组质粒以电穿孔转化法转化不同的宿主，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。通过 喷涂」L茶酚水溶液以及菌落PCR检测。研究结果表明pETPc可以优选适用于革兰氏阴性菌 大肠杆菌((Escherichia coli Mach Tl)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech, Co.))、荧光假单胞菌 CICC 23254 ((Pseudomonas f luorescens CICC 23254)购 自中国工业微生物菌种保藏管理中心)和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌168((BacillUS subtilis 168，ATCC 23857)购自美国标准生物品保藏中心)等。本专利技术进一步对质粒pETPcbphC表达儿茶酚双加氧酶的酶活进行了检测。首先， 将经过验证正确的含有构建质粒的转化子Escherichia coli Mach/pETPcbphC过夜培养。 然后，按1 %接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，摇床震荡培养。每两个小时取样，测定菌体 浓度(OD6J以及儿茶酚双加氧酶BphC的酶活。所述酶活测定方法为超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用 APbuffer (含10%丙酮的pH 7.5的PB缓冲液)稀释至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的儿茶酚 溶液，振荡混勻。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据(见图3)。本专利技术利用细菌III型整合子中的启动子Pc与宽宿主范围表达质粒pET28a构建 了新的表达质粒pETPc，由于启动子Pc具有不需要诱导(即组成型表达)、启动强度高、启动速度快和适用范围广的特点(Xu et al.，2007)，将该启动子插入到质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高启动强度宽宿主组成型表达质粒，命名为ｐＥＴＰｃ，由复制子ｏｒｉ↓［１６００］、筛选标记基因Ｋａｎ（卡那霉素抗性基因）、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Ｐｃ组成；其特征在于，所述质粒ｐＥＴＰｃ的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．４所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Ｐｃ的核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．１所示。

【技术特征摘要】
一种高启动强度宽宿主组成型表达质粒，命名为pETPc，由复制子ori1600、筛选标记基因Kan(卡那霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，徐友强，陶飞，马翠卿，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]