【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、多肽可以用于各种目的，诸如治疗。定向进化或选择策略可以用于鉴定感兴趣的多肽。蛋白质展示的方法可以与定向进化结合使用。定向进化技术可以使用蛋白质展示来筛选感兴趣的多肽。定向进化和筛选技术在鉴定感兴趣的多肽方面可能是有效的，但是由于序列空间的复杂性和缺乏序列多样性，可能会无意中丢失潜在有价值的多肽。
技术实现思路
1、本文提供了用于分析大量多肽的方法、系统和组合物。这些方法、系统和组合物可以允许产生具有特定特征的多肽。这些方法、系统和组合物可以使用多核苷酸和多肽文库以及多肽展示方法来开发感兴趣的多肽。
2、在一方面，本公开提供了一种用于鉴定优化的多肽的高通量方法，其包括：(a)提供编码变体多肽的第一文库的多核苷酸的第一文库；(b)加工多核苷酸的第一文库以产生变体多肽的第一文库，其中变体多肽附接于多核苷酸的第一文库；(c)鉴定一个或多个特征，一个或多个特征包括变体多肽的第一文库的至少一部分的平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间；(d)提供多核苷酸的第二文库，多核苷酸的第二文库编码至少基于(c)中鉴定的一个或多个特征选择的变体多肽的第二文库；(e)加工多核苷酸的第二文库以产生变体多肽的第二文库，其中变体多肽附接于多核苷酸的第二文库；以及(f)分析变体多肽的第二文库以产生优化的数据。
3、在另一方面，本公开提供了一种用于测量多肽的特征的高通量方法，其包括：(a)
4、在另一方面，本公开提供了一种用于筛选多个多肽的高通量方法，其包括：(a)提供编码变体多肽的文库的多核苷酸的第一文库，其中变体多肽的第一文库包含所有单氨基酸变体的至少90％，其中氨基酸残基被选自二十种不同氨基酸的集合的氨基酸取代；(b)加工多核苷酸的第一文库以产生变体多肽的第一文库，其中变体多肽附接于多核苷酸的第一文库；以及(c)鉴定变体多肽的第一文库中的多肽的一个或多个特征。
5、在另一方面，本公开提供了一种用于筛选多个多肽的高通量方法，其包括：(a)提供编码变体多肽的第一文库的多核苷酸的第一文库，其中变体多肽的第一文库包含对应于参考多肽中给定参考序列的至少90％的可能单核苷酸变体的单氨基酸变体多肽，其中对于给定的单氨基酸变体，氨基酸残基被选自二十种不同氨基酸的集合的另一种氨基酸取代；(b)加工多核苷酸的第一文库以产生变体多肽的第一文库，其中变体多肽附接于多核苷酸的第一文库；以及(c)鉴定变体多肽的第一文库中的多肽的一个或多个特征。
6、一些实施方案中，一个或多个特征包括变体多肽的第一文库的至少一部分的平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间。
7、在一些实施方案中，方法进一步包括：(d)提供编码至少基于在(c)中鉴定的一个或多个特征而选择的变体多肽的第二文库的多核苷酸的第二文库；(e)加工多核苷酸的第二文库以产生变体多肽的第二文库，其中变体多肽附接于多核苷酸的第二文库；以及(f)分析变体多肽的第二文库以产生优化的数据。在一些实施方案中，方法进一步包括(g)基于优化的数据来鉴定优化的多肽。在一些实施方案中，高通量方法不包括细胞。在一些实施方案中，多核苷酸的第一文库是脱氧核糖核酸分子的文库。
8、在一些实施方案中，平衡结合常数是解离常数(kd)。在一些实施方案中，平衡结合常数是缔合常数(ka)。在一些实施方案中，动力学结合常数是缔合速率常数(kon)。在一些实施方案中，动力学结合常数是解离速率常数(koff)。在一些实施方案中，蛋白质稳定性测量值是蛋白质解链温度(tm)。在一些实施方案中，蛋白质稳定性测量值是化学变性剂的中点变性浓度(cm)。
9、在一些实施方案中，方法进一步包括在(d)中，从变体多肽的第一文库中鉴定阴性变异、阳性变异和中性变异。在一些实施方案中，中性变异具有大于起始多肽的解离常数的0.25倍且小于其2倍的解离常数。在一些实施方案中，阳性变异具有小于或等于起始多肽的解离常数的0.25倍的解离常数。在一些实施方案中，阴性变异具有大于或等于起始多肽的解离常数的2倍的解离常数。
10、在一些实施方案中，变体多肽的第一文库包含单氨基酸变体，其中氨基酸残基被选自氨基酸的集合的氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸的集合包含10种不同的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸的集合包含20种不同的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸的集合包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库由起始多肽的变体和起始多肽组成。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库包含相互作用氨基酸对的双氨基酸变体。在一些实施方案中，相互作用氨基酸对的双氨基酸变体包括其中相互作用氨基酸对的氨基酸残基被所有二十种氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，相互作用氨基酸对通过原始多肽的晶体结构来鉴定。在一些实施方案中，相互作用氨基酸对包括多肽间相互作用和多肽内相互作用。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库在每个位置处包含单氨基酸插入。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库包含单氨基酸缺失。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库包含双氨基酸缺失。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库包含三氨基酸缺失。在一些实施方案中，变体多肽的第一文库包含至少四氨基酸缺失。在一些实施方案中，分析变体多肽的第一文库包括转录和翻译变体多核苷酸的第一文库中的多核苷酸，其中由多核苷酸编码的多肽附接于多核苷酸。在一些实施方案中，鉴定平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间包括对变体多肽的第一文库进行结合测定。在一些实施方案中，鉴定平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间包括对多核苷酸的第一文库进行测序并将多核苷酸的第一文库的序列与结合测定相关联。在一些实施方案中，结合测定包括测定变体多肽的第一文库与抗原的结合。在一些实施方案中，结合测定包括测定变体多肽的第一文库与多于一个抗原的结合。在一些实施方案中，结合测定包括测定变体多肽的第一文库与多个抗原的结合。在一些实施方案中，方法进一步包括鉴定与多个抗原中的两个或更多个抗原结合的变体多肽。在一些实施方案中，进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定优化的多肽的高通量方法，所述方法包括：
2.一种用于测量多肽的特征的高通量方法，所述方法包括：
3.一种用于筛选多个多肽的高通量方法，所述方法包括：
4.一种用于筛选多个多肽的高通量方法，所述方法包括：
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述一个或多个特征包括所述变体多肽的第一文库的至少一部分的平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其进一步包括：(d)提供编码至少基于在(c)中鉴定的一个或多个特征而选择的变体多肽的第二文库的多核苷酸的第二文库；(e)加工所述多核苷酸的第二文库以产生所述变体多肽的第二文库，其中所述变体多肽附接于所述多核苷酸的第二文库；以及(f)分析所述变体多肽的第二文库以产生优化的数据。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其进一步包括(g)基于所述优化的数据来鉴定优化的多肽。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述高
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的第一文库是脱氧核糖核酸分子的文库。
10.根据权利要求1、2和5-9中任一项所述的方法，其中所述平衡结合常数是解离常数(Kd)。
11.根据权利要求1、2和5-9中任一项所述的方法，其中所述平衡结合常数是缔合常数(Ka)。
12.根据权利要求1、2和5-11中任一项所述的方法，其中所述动力学结合常数是缔合速率常数(kon)。
13.根据权利要求1、2和5-11中任一项所述的方法，其中所述动力学结合常数是解离速率常数(koff)。
14.根据权利要求1、2和5-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质稳定性测量值是蛋白质解链温度(Tm)。
15.根据权利要求1、2和5-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质稳定性测量值是化学变性剂的中点变性浓度(Cm)。
16.根据权利要求1、2和5-15中任一项所述的方法，其进一步包括在(d)中，从所述变体多肽的第一文库中鉴定阴性变异、阳性变异和中性变异。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述中性变异具有大于起始多肽的解离常数的0.25倍且小于其2倍的解离常数。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述阳性变异具有小于或等于起始多肽的解离常数的0.25倍的解离常数。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述阴性变异具有大于或等于起始多肽的解离常数的2倍的解离常数。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含单氨基酸变体，其中氨基酸残基被选自氨基酸的集合的氨基酸取代。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸的集合包括10种不同的氨基酸。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸的集合包括20种不同的氨基酸。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸的集合包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库由起始多肽的变体和所述起始多肽组成。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含相互作用氨基酸对的双氨基酸变体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述相互作用氨基酸对的双氨基酸变体包括其中所述相互作用氨基酸对的氨基酸残基被所有二十种氨基酸取代的变体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述相互作用氨基酸对通过所述原始多肽的晶体结构来鉴定。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述相互作用氨基酸对包括多肽间相互作用和多肽内相互作用。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库在每个位置处包含单氨基酸插入。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含单氨基酸缺失。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含双氨基酸缺失。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含三氨基酸缺失。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于鉴定优化的多肽的高通量方法，所述方法包括：
2.一种用于测量多肽的特征的高通量方法，所述方法包括：
3.一种用于筛选多个多肽的高通量方法，所述方法包括：
4.一种用于筛选多个多肽的高通量方法，所述方法包括：
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述一个或多个特征包括所述变体多肽的第一文库的至少一部分的平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其进一步包括：(d)提供编码至少基于在(c)中鉴定的一个或多个特征而选择的变体多肽的第二文库的多核苷酸的第二文库；(e)加工所述多核苷酸的第二文库以产生所述变体多肽的第二文库，其中所述变体多肽附接于所述多核苷酸的第二文库；以及(f)分析所述变体多肽的第二文库以产生优化的数据。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其进一步包括(g)基于所述优化的数据来鉴定优化的多肽。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述高通量方法不包括细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的第一文库是脱氧核糖核酸分子的文库。
10.根据权利要求1、2和5-9中任一项所述的方法，其中所述平衡结合常数是解离常数(kd)。
11.根据权利要求1、2和5-9中任一项所述的方法，其中所述平衡结合常数是缔合常数(ka)。
12.根据权利要求1、2和5-11中任一项所述的方法，其中所述动力学结合常数是缔合速率常数(kon)。
13.根据权利要求1、2和5-11中任一项所述的方法，其中所述动力学结合常数是解离速率常数(koff)。
14.根据权利要求1、2和5-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质稳定性测量值是蛋白质解链温度(tm)。
15.根据权利要求1、2和5-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质稳定性测量值是化学变性剂的中点变性浓度(cm)。
16.根据权利要求1、2和5-15中任一项所述的方法，其进一步包括在(d)中，从所述变体多肽的第一文库中鉴定阴性变异、阳性变异和中性变异。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述中性变异具有大于起始多肽的解离常数的0.25倍且小于其2倍的解离常数。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述阳性变异具有小于或等于起始多肽的解离常数的0.25倍的解离常数。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述阴性变异具有大于或等于起始多肽的解离常数的2倍的解离常数。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含单氨基酸变体，其中氨基酸残基被选自氨基酸的集合的氨基酸取代。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸的集合包括10种不同的氨基酸。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸的集合包括20种不同的氨基酸。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述氨基酸的集合包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库由起始多肽的变体和所述起始多肽组成。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含相互作用氨基酸对的双氨基酸变体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述相互作用氨基酸对的双氨基酸变体包括其中所述相互作用氨基酸对的氨基酸残基被所有二十种氨基酸取代的变体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述相互作用氨基酸对通过所述原始多肽的晶体结构来鉴定。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述相互作用氨基酸对包括多肽间相互作用和多肽内相互作用。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库在每个位置处包含单氨基酸插入。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含单氨基酸缺失。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含双氨基酸缺失。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含三氨基酸缺失。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含至少四氨基酸缺失。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中分析所述变体多肽的第一文库包括转录和翻译所述变体多核苷酸的第一文库中的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述多肽附接于所述多核苷酸。
35.根据权利要求1、2和5-34中任一项所述的方法，其中鉴定所述平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间包括对所述变体多肽的第一文库进行结合测定。
36.根据权利要求35所述的方法，其中鉴定所述平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间包括对所述多核苷酸的第一文库进行测序，并且将所述多核苷酸的第一文库的序列与所述结合测定相关联。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述结合测定包括测定所述变体多肽的第一文库与抗原的结合。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述结合测定包括测定所述变体多肽的第一文库与多于一个抗原的结合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述结合测定包括测定所述变体多肽的第一文库与多个抗原的结合。
40.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括鉴定结合至所述多个抗原中的两个或更多个抗原的变体多肽。
41.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括鉴定结合至所述多个抗原中的至少一个抗原且未结合至所述多个抗原中的不同抗原的变体多肽。
42.根据权利要求39所述的方法，其进一步包括鉴定未结合至所述多个抗原的变体多肽。
43.根据权利要求1、2和5-38所述的方法，其中所述鉴定所述平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间包括产生多于一个靶标的结合数据。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述第二文库至少基于多于一个靶标的结合数据而产生。
45.根据权利要求1和6-44中任一项所述的方法，其中加工所述变体多肽的第二文库包括转录和翻译所述变体多核苷酸的第二文库中的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述多肽附接于所述多核苷酸。
46.根据权利要求1和6-45中任一项所述的方法，其中所述鉴定所述优化的多肽包括对由所述多核苷酸的第二文库编码的所述变体多肽的第二文库进行结合测定。
47.根据权利要求46所述的方法，其中鉴定所述平衡结合常数、动力学结合常数、蛋白质稳定性测量值、酶活性、分数活性、非特异性结合潜力、聚集潜力、疏水性、蛋白质表达水平或成熟时间包括对所述多核苷酸的第二文库进行测序，并且将所述多核苷酸的第二文库的序列与所述结合测定相关联。
48.根据权利要求1和6-47中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第二文库包含至少104个多肽。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的第一文库包含至少106个多核苷酸。
50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含至少104个多肽。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述方法在少于48小时内进行。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含单独的vhh抗体的文库。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述变体多肽的第二文库包含vhh抗体融合体的文库。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述变体多肽的第一文库包含单独的单链可变片段(scfv)的文库。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述变体多肽的第二文库包含单独的单链可变片段(scfv)融合体的文库。
56.一种用于鉴定优化的多肽的高通量方法，所述方法包括：
57.一种用于鉴定优化的多肽的方法，所述方法包括：
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述数据集通过鉴定所述第一多个多肽中可以与所述抗原相互作用的多肽而产生。
59.根据权利要求56或58所述的方法，其中至少通过将所述抗原暴露于所述第一多个多肽并检测所述第一多个多肽中的至少一个多肽与所述抗原的相互作用来产生所述数据集。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一多个多肽通过以下产生：(i)提供编码多个第一多肽的多个第一多核苷酸；(ii)提供附接于固体表面的多个第一捕获探针，所述多个第一捕获探针被配置为退火到所述第一多个多核苷酸以产生多个捕获的多核苷酸；(iii)加工所述多个捕获的多核苷酸以产生所述第一多个多肽。
61.根据权利要求56和58-60中任一项所述的方法，其中与第一多个多肽有关的数据包括至少通过对所述多个捕获的多核苷酸进行测序而产生的序列数据，其中所述多个捕获的多核苷酸是多个vhh多核苷酸。
62.根据权利要求56-61中任一项所述的方法，其中检测所述多个多肽中的至少一个多肽与所述抗原的所述相互作用包括鉴定所述多肽的定量特征。
63.根据权利要求62所述的方法，其中鉴定所述多肽的所述定量特征进一步包括将所述多肽鉴定为包含阴性突变、中性突变或阳性突变中的一种或多种。
64.根据权利要求56和58-63中任一项所述的方法，其中所述多个融合多肽包含所述第一多个多肽的所述多肽的所有可能融合对组合或排列的至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的多肽。
65.根据权利要求56和58-63中任一项所述的方法，其中所述多个融合多肽包含所述第一多个多肽的所述多肽的所有可能的融合对组合或排列的多肽。
66.根据权利要求57所述的方法，其中所述数据集包含对应于单结构域多肽的数据，所述单结构域多肽对应于所述融合多肽的一个或结构域。
67.根据权利要求57或66所述的方法，其中所述数据集通过鉴定可以与所述抗原相互作用的单结构域多肽来产生。
68.根据权利要求57和66-67中任一项所述的方法，其中至少通过将所述抗原暴露于多个单结构域多肽并且检测所述多个单结构域多肽中的至少一个单结构域多肽与所述抗原的相互作用来产生数据集。
69.根据权利要求57和66-68中任一项所述的方法，其中所述多个单结构域多肽通过以下产生：(i)提供编码多个单结构域多肽的多个单结构域多核苷酸，其中所述单结构域多核苷酸偶联至固体表面；(iii)加工所述多个单结构域多核苷酸以产生所述多个单结构域多核苷酸多肽。
70.根据权利要求57和66-69中任一项所述的方法，其中所述数据集包含至少通过对所述多个单结构域多核苷酸进行测序而产生的序列数据。
71.根据权利要求57和66-70中任一项所述的方法，其中所述单结构域多肽包含vhh。
72.根据权利要求57和66-71中任一项所述的方法，其中所述融合多肽包含vhh-vhh融合体。
73.根据权利要求57和66-72中任一项所述的方法，其中所述多个融合多肽包含对应于所述多个单结构域多肽中的一个或多个多肽的序列。
74.根据权利要求57和66-73中任一项所述的方法，其中所述多个融合肽的...
【专利技术属性】
技术研发人员：柯蒂斯·詹姆斯·雷顿，帕瓦那普雷桑·普什帕吉里·威德亚纳森，迈克尔·罗伊·戈特里克，
申请(专利权)人：普罗蒂琳生物科学公司，
类型：发明
国别省市：
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