【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学检测，特别是涉及同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的引物组及应用。
技术介绍
1、马耳他布鲁氏菌(brucella melitensis)、流产衣原体(chlamydia abortus)和弓形虫(toxoplasmagondii)均为人畜共患病原体且在世界范围内广泛分布存在。三者均是导致羊群发生流产现象的主要病原体，人群通过接触患病动物及流产胎儿或吸入阳性气溶胶而感染。
2、布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫这3种病原体均寄生与宿主细胞内，一旦感染导致发病难以通过常规手段进行清除治疗。近几年来，羊群流产病例多发，布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫这3种病原体在全球范围内呈现出感染阳性率增高、感染分布范围扩大、在病源地持续分布存在等特点。3种病原所致临床感染特点相似，在发病早期难以通过临床症状进行辨别，容易通过病畜及污染的动物源性产品传染感染，所以在疾病早期快速准确的做出诊断十分重要。
3、目前针对布鲁氏菌、流产衣原体及弓形虫的大规模检测主要依靠血清学及病原形态学鉴定，这一类方法检测周期长、程序繁复、工作量大难以适应目前的规模化养殖模式所需的快速检疫要求。目前虽然存在多种分别针对布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的pcr检测方法，但分别检测不仅耗时且检测效率低。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的引物组及应用。本专利技术提供的引物组可以同时检测布鲁氏菌、流产衣原体及弓形虫，具有高效性、系统性和经
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种多重pcr检测布鲁氏菌(brucella)、流产衣原体和弓形虫的引物组，包括bru-f、bru-r、cab-f、cab-r、tox-f和tox-r；所述bru-f的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述bru-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cab-f的核苷酸序列如seq idno.3所示，所述cab-r的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tox-f的核苷酸序列如seq idno.5所示，所述tox-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。
4、本专利技术提供了上述技术方案所述的引物组在制备检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的试剂盒中的应用。
5、本专利技术提供了一种多重pcr检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组。
6、优选的，所述试剂盒还包括多重pcr扩增所使用的试剂、阴性对照品和阳性对照品。
7、优选的，所述多重pcr扩增所使用的试剂包括dna聚合酶和无菌双蒸水。
8、优选的，所述阳性对照品包括核苷酸序列如seq id no.11～seq id no.13所示的核酸；所述阴性对照品包括无菌双蒸水。
9、本专利技术提供了一种非诊断目的同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的方法，包括以下步骤：
10、以待测样本的基因组dna为模板，利用引物组或试剂盒进行多重pcr扩增，得到扩增产物；所述引物组为上述技术方案所述的引物组，所述试剂盒为上述技术方案所述的试剂盒；
11、结果判定：
12、若所述扩增产物中存在长度为429bp的片段或存在核苷酸序列为seq id no.11所示的核酸，则待测样本中含有布鲁氏菌；
13、若所述扩增产物中存在长度为544bp的片段或存在核苷酸序列为seq id no.12所示的核酸，则待测样本中含有流产衣原体；
14、若所述扩增产物中存在长度为261bp的片段或存在核苷酸序列为seq id no.13所示的核酸，则待测样本中含有弓形虫。
15、优选的，所述多重pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃终延伸7min。
16、优选的，所述多重pcr扩增的反应体系包括：2×taq dna聚合酶mix 25μl，引物组中的bru-f、bru-r、cab-f、cab-r、tox-f和tox-r各1μl，待检样本的基因组dna 5μl和无菌双蒸水14μl。
17、优选的，所述bru-f、bru-r、cab-f、cab-r、tox-f和tox-r在反应体系的终浓度均为0.2μmol/l。
18、有益效果：
19、本专利技术提供了一种多重pcr检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的引物组，包括bru-f、bru-r、cab-f、cab-r、tox-f和tox-r；所述bru-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述bru-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cab-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cab-r的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tox-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tox-r的核苷酸序列如seq id no.6所示。本专利技术提供的引物组可以同时检测布鲁氏菌、流产衣原体及弓形虫，具有灵敏度高、特异性强、可重复性强、高效性、系统性和经济简便性的优点。其中，在本专利技术的多重pcr扩增体系中，布鲁氏菌和流产衣原体的dna模板拷贝数数量在103时、弓形虫的dna模板拷贝数数量在102时，均能扩增出条带，表明本专利技术引物组的灵敏度高；提取猪细小病毒(porcine parvovirus)、铜绿假单胞杆菌(pseudomonasaeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、大肠杆菌(escherichia coli)以及b、c、d、e型产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)的基因组dna为模板，利用本专利技术所述引物组进行多重pcr特异性验证扩增，未见有pcr扩增产物，说明本专利技术引物组的特异性强。以布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的混合质粒dna作为模板，使用本专利技术所述引物组在不同的pcr仪上进行了8次重复性扩增验证，均扩出了429bp、544bp和261bp三个特异性片段，表明本专利技术引物组的可重复性强。本专利技术引物组中的三对引物在同一反应体系中进行pcr扩增反应时互不干扰，表明本专利技术提供的引物组具有高效性、系统性和经济简便性的优点，为临床和实验室对布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫快速准确检测提供了更优办法。
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1.一种多重PCR检测布鲁氏菌(Brucella)、流产衣原体(Chlamydia abortus)和弓形虫(Toxoplasmagondii)的引物组，其特征在于，包括Bru-F、Bru-R、Cab-F、Cab-R、Tox-F和Tox-R；所述Bru-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Bru-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Cab-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述Cab-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述Tox-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Tox-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的试剂盒中的应用。
3.一种多重PCR检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR扩增所使用的试剂、阴性对照品和阳性对照品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR扩增所使用
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13所示的核酸；所述阴性对照品包括无菌双蒸水。
7.一种非诊断目的同时检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸35S，35个循环；72℃终延伸7min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应体系包括：2×Taq DNA聚合酶Mix 25μL，引物组中的Bru-F、Bru-R、Cab-F、Cab-R、Tox-F和Tox-R各1μL，待检样本的基因组DNA 5μL和无菌双蒸水14μL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述Bru-F、Bru-R、Cab-F、Cab-R、Tox-F和Tox-R在反应体系的终浓度均为0.2μmol/L。
...【技术特征摘要】
1.一种多重pcr检测布鲁氏菌(brucella)、流产衣原体(chlamydia abortus)和弓形虫(toxoplasmagondii)的引物组，其特征在于，包括bru-f、bru-r、cab-f、cab-r、tox-f和tox-r；所述bru-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述bru-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cab-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cab-r的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tox-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tox-r的核苷酸序列如seq idno.6所示。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的试剂盒中的应用。
3.一种多重pcr检测布鲁氏菌、流产衣原体和弓形虫的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重pcr扩增所使用的试剂、阴性对照品和阳性对照品。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重pcr...
【专利技术属性】
技术研发人员：周继章，李韦，陈启伟，宫晓炜，王萌，李兆才，翟军军，金有顺，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心，
类型：发明
国别省市：
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