【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，特别涉及一种检测hist1h4f基因甲基化的试剂盒。
技术介绍
1、据世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)发布的2020年全球癌症负担数据显示，癌症成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。癌症的筛查和早诊早治已被公认为癌症防控的最有效手段，基因甲基化是一种细胞表观遗传修饰，与基因组表达的生理控制密切相关。研究证实基因的高度甲基化伴随着或早于细胞恶性增生，可以作为非常有效的癌症发生的生物标记物。目前已有dna甲基化产品可用于肿瘤的早筛、早期诊断、疗效预测、预后判断。
2、例如hist1h4f基因甲基化能用于肺癌检测，检测265个支气管肺泡灌洗液样本，灵敏度和特异性分别为87.0％和96.7％，另外在tcga数据分析中，肝癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌头，颈部鳞状细胞癌，膀胱尿路上皮癌，胰腺癌，子宫内膜癌8种癌症总体的检测灵敏度和特异性分别为78.2％和95.2％。又如pcdhgb7基因甲基化能区分13种癌种癌组织和对照组织，其综合的真实检出率概率值auc(area under curve)大于0.85。以及prkcb基因的甲基化在肺癌，肠腺癌，直肠癌，食管癌等各种常见癌种中具有高度的特异性和灵敏度，检测41例临床病例，特异性达到100％，敏感性达到93.1％。
3、现有用于筛选泛癌生物标志物方法比较复杂以及筛选成本高，需要进行高通量的测序和数据分析，一般是利用甲基化芯片如illumina公司的450k进行各种癌组织样本和癌旁组织全基因组测序和比对，从而获得甲基化的信息。其使用的测序芯片价
4、荧光pcr法是最为常见而且最有效率检测基因甲基化的分子诊断手段之一，它是基于taqman荧光定量pcr技术。甲基化检测过程一般为以重亚硫酸盐处理后dna片段作为模板，未甲基化的胞嘧啶(c)在重亚硫酸盐处理下发生碱基变化成尿嘧啶(u)，5-甲基胞嘧啶(5-mc)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmc)都不会发生碱基的变化。转化处理后的dna经pcr扩增，尿嘧啶(u)转变为胸腺嘧啶(t)。因此通过特异地设计一对引物用于扩增含待测甲基化位点的小片段dna，同时用一个与待测甲基化位点杂交互补的探针来区分甲基化c和未甲基化而转变的u。探针5'端一般带有报告荧光基团，3'端带有荧光淬灭基团，通过荧光信号检测进行实时定量。
5、荧光法用于检测基因甲基化的方法往往特异性不好，灵敏度受限，其原因有：检测甲基化位点一般在探针上，由于用于检测甲基化序列的探针与非甲基化的模板只有1个c和u的错配，pcr扩增中taq酶可以兼容少数碱基的错配，导致探针与非甲基化模板结合产生非特异的信号。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于公开了一种检测hist1h4f基因甲基化的试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面在于提供一种检测hist1h4f基因甲基化的试剂盒。所述试剂盒包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术基于扩增阻滞突变系统pcr(amrs-pcr)对甲基化位点进行特异性的识别。所述上游引物的3’端最后一个碱基为hist1h4f基因的甲基化位点，并且在所述上游引物中部加入若干碱基错配，从而提高特异性。
5、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述试剂盒还包括核苷酸序列如seq idno.3所示的探针。
6、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述试剂盒还包括内参对照，所述内参对照包括对照上游引物、对照下游引物和对照探针，所述内参对照靶向actb、b2m、gapdh或18srrna。所述内参对照用于评价待测样品的模板质量。当所述内参对照的ct值过高或过低时则能判断待测样品不合格。
7、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述探针和所述对照探针的5’端分别标记有不同的荧光基团。所述试剂盒采用同管复合扩增技术，因此所述探针和所述对照探针需要使用不同的荧光基团来让检测设备区分反应体系中的荧光信号是源于所述探针还是所述对照探针。
8、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述探针的5’端标记fam荧光基团，所述对照探针的5’端标记vic荧光基团。
9、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述探针的3’端标记有bhq1淬灭基团，所述对照探针的3’端标记有bhq2淬灭基团。
10、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述对照上游引物的核苷酸序列如seq idno.10所示，所述对照下游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述对照探针的核苷酸序列如seq id no.12所示。
11、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，调配反应体系时，所述上游引物的终浓度为0.4μm，所述下游引物的终浓度为0.4μm，所述探针的终浓度为0.4μm，所述对照上游引物的终浓度为0.1μm，所述对照下游引物的终浓度为0.1μm，所述对照探针的终浓度为0.1μm。
12、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述试剂盒还包括2×qpcr master mix。
13、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述试剂盒的反应程序为：95℃变性5分钟；95℃持续15秒，55℃持续40秒，循环45次；检测荧光信号。
14、本专利技术的优点在于：
15、所述上游引物靶向hist1h4f基因的cg08260959位点。基于此而构建的amrs-pcr甲基化检测体系具有良好的特异性和灵敏性。在2ng/μl的正常细胞dna背景浓度下检测到0.01ng/μl癌细胞dna，证明所述试剂盒能用于泛癌检测。
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1.一种检测HIST1H4F基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括内参对照，所述内参对照包括对照上游引物、对照下游引物和对照探针，所述内参对照靶向ACTB、B2M、GAPDH或18S rRNA。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述探针和所述对照探针的5’端分别标记有不同的荧光基团。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记FAM荧光基团，所述对照探针的5’端标记VIC荧光基团。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述探针的3’端标记有BHQ1淬灭基团，所述对照探针的3’端标记有BHQ2淬灭基团。
7.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述对照上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，所述对
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述上游引物的终浓度为0.4μM，所述下游引物的终浓度为0.4μM，所述探针的终浓度为0.4μM，所述对照上游引物的终浓度为0.1μM，所述对照下游引物的终浓度为0.1μM，所述对照探针的终浓度为0.1μM。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括2×qPCR Master Mix。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，检测的反应程序为：95℃变性5分钟；95℃持续15秒，55℃持续40秒，循环45次。
...【技术特征摘要】
1.一种检测hist1h4f基因甲基化的试剂盒，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，还包括核苷酸序列如seq id no.3所示的探针。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括内参对照，所述内参对照包括对照上游引物、对照下游引物和对照探针，所述内参对照靶向actb、b2m、gapdh或18s rrna。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述探针和所述对照探针的5’端分别标记有不同的荧光基团。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记fam荧光基团，所述对照探针的5’端标记vic荧光基团。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述探针的3’...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄小君，张伟芳，尹丽琴，许美景，
申请(专利权)人：厦门腾基医疗科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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