一种用秀丽线虫建立食品与饲料中甾体类激素污染物生物模型及方法，属于食品、饲料安全检测技术领域，其模型是：用秀丽线虫建立食品与饲料中甾体类激素污染物生物模型。其方法是：用秀丽线虫建立甾体类激素纯品生物模型，用秀丽线虫建立食品中甾体类激素生物模型，用秀丽线虫建立饲料中甾体类激素生物模型。有益效果是：１、对研究甾体类激素对人类健康的影响具有重大意义。２、实验过程周期短、高效、简洁、方便、对仪器要求少，成本低，应用价值大。３、对处于幼虫第一期的秀丽线虫进行甾体类激素的暴露，测定秀丽线虫从幼虫第一期到开始产卵的这段时间及世代时间，来鉴定在甾体类激素影响下的生物早熟现象。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品安全检测、饲料安全检测等
技术介绍
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C. elegans)是一种可以独立生存的线虫，其个体小，成体仅I. 5mm长，为雌雄同体，雄性个体仅占群体的0. 2%，可自体受精或双性生殖，在20°C下平均生活史为3. 5天，平均繁殖力为300-350个，但若与雄虫交配，可产生多达1400个以上的后代。秀丽线虫的基因组大小为97Mb，分布于6条染色体，预测有编码基因19717个，基因组序列40%与人类同源，这就意味着它与更高等的生物体共有一些相似的细胞及分子结构以及控制通路；它是第一个基因体完全被定序的多细胞真核生物，且每 一个体细胞的发育情况都研究得较为清楚，这个细胞世系的规律在各个个体之间是几乎不变的；其遗传背景清楚、个体结构简单、生活史短；并且标本便宜、在实验室中容易掌控。因此在衰老与寿命、人类遗传性疾病、动物的应急反应、环境生物学等领域得到广泛应用。例如用秀丽线虫测定药品与个人护理品的世代毒性的方法(公开号CN 101451983A)等。留体类激素是众多环境激素类物质的一类化合物，其特点是具有很高的稳定性，对人体内分泌有干扰作用。近年来，有关学者研究表明留体类激素对野生生物造成的危害主要表现为生殖器官、生殖机能和生殖行为异常。例如通过PCB-60、-104、-190及雌激素17 3-雌二醇对斑马鱼的实验研究表明，这些激素物质可以大大增加鱼类胚胎和幼体死亡率；长期暴露于IOu g/L壬基酚环境中的片脚类动物，其种群密度和生长速度明显降低；在英国海湾生活的雄性比目鱼由于受环境激素的影响，其血液卵黄素浓度有升高的趋势，繁殖行为异常；美国佛罗里达州污染湖泊中的鳄鱼幼体，由于受环境激素的影响，它们体内性激素的调节和甲状腺激素的浓度有所改变。留体类激素在动物体内的残留，通过食物链进入人体，会使人的正常生理功能发生紊乱，使小孩性成熟加快，影响正常生长和发育。食品中留体类激素主要来源于生产源头动植物自身的留体类激素、作为动物饲料添加剂和植物生长调节剂过量使用的外源性留体类激素、以及为了预防、治疗动植物疾病和促进产量时给动植物使用药物中的留体类激素，导致食品中留体类激素水平呈显著上升趋势。国内奶粉促幼儿性早熟事件，使得国家到地方各级政府高度重视。因此利用多细胞真核生物秀丽线虫建立食品及饲料中留体类激素污染物安全性生物模型是非常必要的，为食品与饲料中留体类激素污染物检测提供新方法。目前国内外对食品与饲料中留体类激素的研究方法主要有高效液相色谱法、放射免疫分析法、分光光度法、薄层层析法、气相色谱-质谱(GC-MS)法等化学方法和生物方法，这些方法都是从定量的角度来研究留体类激素，并且成本高、周期长，对实验人员的技术要求也较高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用秀丽线虫生物模型对留体类激进行检测的方法，利用多细胞真核生物秀丽线虫建立食品及饲料中留体类激素污染物安全性生物模型，为人类的食品安全问题提供理论、技术基础和新型检测方法。本专利技术的技术方案如下用秀丽线虫建立食品与饲料中留体类激素污染物生物模型。本专利技术的方法是一、利用秀丽线虫生物模型对甾体类激素纯品进行安全性危害检测的方法I、获得同步化的秀丽线虫幼虫第一期(LI期)虫液将正在产卵期的秀丽线虫雌雄同体成虫用M9缓冲液从NGM培养板中洗下，1500rpm离心lmin，弃去上清。如上法再用M9缓冲液清洗一次后将含秀丽线虫的M9缓冲液定容于容器内，并加入等体积裂解液,上下颠倒混勻3-5min后1500rpm离心3min,弃去上清,收集底部沉淀。沉淀改用无菌的S-Medium 反复清洗2-3次至pH值达到中性，此时秀丽线虫虫体已被裂解而虫卵仍然保存完好。将含有秀丽线虫虫卵的无菌的S-Medium溶液放于生化培养箱内(16°C _25°C )培养8_12h。由于没有食物，虫卵孵化以后会全部停止在秀丽线虫幼虫第一期(LI期)，1500rpm离心3min收集幼虫，备用。2、将甾体类激素纯品溶于体积百分浓度为1%的二甲基亚砜中。3、将秀丽线虫幼虫第一期(LI期)虫液暴露于留体类激素纯品中秀丽线虫采用液体暴露方法进行暴露，设置两组样品，第一组为暴露组用无菌的细胞培养板，每孔加入I步骤收集获得的处于秀丽线虫幼虫第一期(LI期)的虫液及E. coli 0P50及液体NGM培养液及留体类激素纯品，并混匀，留体类激素的终浓度为0. Ing/ml-20ng/ml ;第二组为空白对照组用无菌的细胞培养板，每孔加入I步骤收集获得的处于秀丽线虫幼虫第一期(LI期)的虫液及E. coli 0P50及液体NGM培养液。将这两组样品放入生化培养箱(16°C -25°C )中暴露培养6h后分别用移液枪将样品取出，置于离心管中。4、分别向两组样品的离心管中加入M9缓冲液，摇匀后静置lOmin，去上清液，再加入M9缓冲液，摇匀后静置lOmin，再去上清液，再加入M9缓冲液摇匀。将两组样品取出分别涂布于含有E. coli 0P50的NGM固体培养基上，在生化培养箱(16°C -25°C )中培养直到线虫长到可以挑出的长度为止，将线虫挑出，分别放入新的含有E. coli 0P50的NGM固体培养基上，生化培养箱(16°C-25°C )中培养，每隔一天将线虫挑出到新的含E. coli 0P50NGM固体培养基上，直到产卵期结束。丢失的线虫、因爬到培养皿壁而死亡的线虫以及“虫袋”(worm bag)应从统计数据中排除。采用体视显微镜所带的成像软件对秀丽线虫进行录像，进行如下指标的测定(I)甾体类激素对秀丽线虫生殖系统的影响A、从秀丽线虫幼虫第一期(LI期)到开始产卵时所需要的时间。B、后代数目后代数目即整个产卵期的所有卵数。C、世代时间P0代成虫产卵到其Fl代成虫产卵的时间间隔。(2)甾体类激素对秀丽线虫运动能力的影响A、头部摆动频率将已发育为成虫的线虫挑入溶液中，经过Imin的恢复，记录线虫在Imin内头部摆动的次数(当身体弯曲达到体长的一半作为I次头部摆动)。B、身体弯曲频率将已发育为成虫的线虫挑到一个没有0P50的NGM培养基上，记录下20 s内身体弯曲的次数。假定沿着咽泵的方向为y轴，那么线虫爬行过程中身体沿着相应X轴方向上的I次改变定义为I个身体弯曲。(3)甾体类激素对秀丽线虫生长发育的影响A、寿命以线虫卵孵化开始记为线虫生命起始的0天，以用取虫器末端轻探虫体无反应记为线虫生命终止。线虫寿命期记为线虫从生命起始到生命终止的时间。B、体长的测定线虫身体僵直，无弯曲时的体长。5、重复1、2、3、4步骤，并将秀丽线虫的暴露时间分别修改为12h、18h、24h。获得暴露12h，留体类激素对秀丽线虫各项生理指标的影响结果；暴露18h，留体类激素对秀丽线虫各项生理指标的影响结果；暴露24h，留体类激素对秀丽线虫各项 生理指标的影响结果。6、采用软件0rigin7. 5对数据进行显著性分析，如果暴露在留体类激素中的秀丽线虫的生理指标与没有暴露在留体类激素中的秀丽线虫的生理指标对比具有显著性差异，则说明甾体类激素对秀丽线虫有安全性危害；如果没有显著性差异，则说明甾体类激素对秀丽线虫没有安全性危害。二、利用秀丽线虫生物模型对食品中留体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用秀丽线虫建立食品与饲料中甾体类激素污染物生物模型，其模型是：用秀丽线虫建立食品与饲料中甾体类激素污染物生物模型。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：于源华，张昊，李金海，于化东，张淑华，姚健，宋禹，杨佳新，林铭燕，徐任，
申请(专利权)人：长春理工大学，
类型：发明
国别省市：82[]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。