【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养基，特别涉及一种nk细胞培养的限定化学成分培养基。
技术介绍
1、nk细胞作为免疫效应细胞的重要组成部分，扮演着免疫系统“第一道防线”的角色。nk细胞发挥作用是非mhc分子限制性的，通过抑制性和激活性信号的动态平衡实现。nk细胞的抑制性受体，主要是抑制性ig样受体(kirs)和异二聚体c型凝集素受体(nkg2a)，可与细胞表面的mhc-i结合并传递抑制信号。正常细胞表达足够量的mhc-i类分子，使nk细胞“沉默”，避免被“误杀”。但是肿瘤细胞在生长发展的早期，大部分情况下都会降低mhc-i类分子的表达来避开免疫系统的监视。此时，nk细胞因肿瘤细胞丧失正常表达的mhc-i类分子而使其抑制受体功能丧失，nk细胞活化。nk细胞表面的激活性受体，与肿瘤细胞表面异常或上调表达的非mhc-i类分子配体结合，通过释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞质颗粒直接杀伤肿瘤细胞。
2、正是由于nk细胞具有独特的抗肿瘤效应，不受mhc限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应中的关键角色。在国内外针对肿瘤等疾病的nk细胞药物开发和临床试验、临床研究上有着广泛的应用。nk细胞的制备又是决定着其能否广泛应用的重要基础。
3、目前市场上，nk细胞培养基含有粘附因子、结合蛋白、生长因子、激素等多种成分，这些人源、动物源的蛋白或蛋白水解物存在以下问题：
4、1、常规nk细胞培养基中含蛋白质、蛋白水解物等难以确认来源的物质，使得最终产品的安全性不足，如果这些物质源于动物提取，则其污
5、2、常规nk细胞培养基缺乏明确的化学成分限定，其稳定性不足，在培养基生产过程中，批间差难以受控；
6、3、常规nk细胞培养基含有蛋白质、蛋白水解物等物质，对环境敏感，导致培养基产品运送及保存条件苛刻。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于公开了一种nk细胞培养的限定化学成分培养基，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。限定化学成分培养基是指培养基中的所有成分都是明确的化合物，不含有蛋白质及蛋白水解物等不稳定因素，同时也不含有人源成份、动物源成份等风险组分。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面在于提供一种限定化学成分培养基。
4、本专利技术第二方面在于提供本专利技术第一方面所述限定化学成分培养基的制备方法。
5、本专利技术第三方面在于指出本专利技术第一方面所述限定化学成分培养基能够应用于nk细胞培养。
6、本专利技术第一方面所述限定化学成分培养基的原料由氨基酸、维生素、无机盐、脂质和助剂组成。所述维生素由生物素、氯化胆碱、d-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12和肌醇组成。
7、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述无机盐由无水氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、硝酸钾、碳酸氢钠、氯化钠、一水磷酸二氢钠和五水亚硒酸钠组成。
8、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述助剂由嵌段式聚醚f-68、吐温80、葡萄糖、hepes、酚红和丙酮酸钠组成。
9、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述氨基酸由甘氨酸、l-丙氨酸、l-盐酸精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-组氨酸盐酸盐、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-盐酸赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二钠盐和l-缬氨酸组成。
10、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述脂质由花生四烯酸、胆固醇、维生素e醋酸酯、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸组成。
11、葡萄糖作为培养基中最主要的能源物质被细胞吸收利用，谷氨酰胺是仅次于葡萄糖的第二大能源物质，谷氨酰胺除了用于合成细胞自身物质及目的蛋白外，大部分的谷氨酰胺被转化成谷氨酸，谷氨酸进一步转变成α酮戊二酸后进入tca循环产生能量。
12、氨基酸是细胞合成蛋白的分子基础，包括结构功能蛋白和目的蛋白。
13、维生素作为酶的结合剂，与酶结合后催化细胞的生理活动，如代谢，能量转移等等，培养细胞本身无法合成维生素，因此培养基中维生素是必须添加的一类物质，尤其是b族维生素。
14、无机盐浓度是细胞维持渗透压及电位环境必须的物质。另外钙离子在胞内信号转导中发挥着重要的作用，磷酸盐除了作为缓冲盐之外，也是是核苷酸、核酸与磷脂的组成成分之一。
15、脂质是细胞膜的主要组成之一，细胞膜保证了细胞内环境的相对稳定，同时调节和选择相应物质进出细胞，是物质自由进出细胞的屏障，在物质运输和蛋白分泌过程中也起了很重要的作用。
16、在本专利技术第一方面的一些实施方式中，所述原料的质量浓度如表1所示。
17、表1、所述限定化学成分培养基的原料表
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20、本专利技术第二方面所述制备方法，包括以下步骤：
21、精密天平称取所需体积的所述脂质，溶于适量的无水乙醇中，均匀搅拌直至充分溶解，获得醇溶液；
22、精密天平称取所需体积的氨基酸、维生素、无机盐和助剂，溶于适量的细胞培养用水中，获得水溶液；
23、将所述醇溶液与所述水溶液混匀，调节ph，过滤后即制成所述限定化学成分培养基。
24、在本专利技术第二方面的一些实施方式中，所述限定化学成分培养基的ph值为7.0～7.2。
25、在本专利技术第二方面的一些实施方式中，所述限定化学成分培养基在调节ph后经0.22微米的过滤器过滤除菌。
26、本专利技术的优点在于：
27、所述限定化学成分培养基由于不含有不确定成份，因此具有良好的原材料可追溯性和更好的批次间一致性；同时，由于具有明确的化合物配方，所以更有利于分析细胞的分泌产物。所述限定化学成分培养基有助于nk细胞的研究、产品开发，以及临床应用。
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1.一种限定化学成分培养基，其特征在于，原料由氨基酸、维生素、无机盐、脂质和助剂组成，所述维生素由生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12和肌醇组成。
2.根据权利要求1所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述无机盐由无水氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、硝酸钾、碳酸氢钠、氯化钠、一水磷酸二氢钠和五水亚硒酸钠组成。
3.根据权利要求2所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述助剂由嵌段式聚醚F-68、吐温80、葡萄糖、HEPES、酚红和丙酮酸钠组成。
4.根据权利要求3所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述氨基酸由甘氨酸、L-丙氨酸、L-盐酸精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐和L-缬氨酸组成。
5.根据权利要求4所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述脂质由花生四烯酸、胆固醇、维生素E醋酸酯、亚
6.根据权利要求5所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述原料的质量浓度分别为：
7.权利要求1至6任一项所述限定化学成分培养基的制备方法，其特征在于：将所述原料中的脂质溶于适量的无水乙醇中，获得醇溶液；
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述限定化学成分培养基的pH值为7.0～7.2。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述限定化学成分培养基在调节pH后经0.22微米的过滤器过滤除菌。
10.权利要求1至6任一项所述限定化学成分培养基在NK细胞培养中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种限定化学成分培养基，其特征在于，原料由氨基酸、维生素、无机盐、脂质和助剂组成，所述维生素由生物素、氯化胆碱、d-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12和肌醇组成。
2.根据权利要求1所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述无机盐由无水氯化钙、无水硫酸镁、氯化钾、硝酸钾、碳酸氢钠、氯化钠、一水磷酸二氢钠和五水亚硒酸钠组成。
3.根据权利要求2所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述助剂由嵌段式聚醚f-68、吐温80、葡萄糖、hepes、酚红和丙酮酸钠组成。
4.根据权利要求3所述限定化学成分培养基，其特征在于，所述氨基酸由甘氨酸、l-丙氨酸、l-盐酸精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-胱氨酸二盐酸盐、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-组氨酸盐酸盐、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-盐酸赖氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-...
【专利技术属性】
技术研发人员：许峻荣，吴远武，王永立，武岳，陈智聪，冯嘉昆，王进辉，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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