本发明专利技术公开了一种杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法。该方法包括杉木未成熟种子胚的准备、ＥＳＭ的起始诱导、ＥＭＳ的维持与增殖、体胚的成熟前期培养、体胚的成熟培养和体胚的萌发。本发明专利技术再生杉木植株的方法，其优势在于繁殖系数高、繁殖不受季节的限制，为杉木遗传改良材料的快速繁殖提供了一种高效途径，不仅有利于杉木遗传资源的保存，而且对于加速杉木优良材料的繁育，提供大量经遗传改良的种植材料，缓解社会对杉木遗传改良苗木的紧迫需求，提供了一种周期短、效率高、成本低的良种苗木的生产技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及林业中的种苗繁殖生物
，具体涉及一种诱导杉木优树杂交组 合的未成熟合子胚胚性胚柄细胞团(Embryonal Suspensor Mass，简称ESM)离体增殖，发育 成完整体细胞胚并再生植株的方法。
技术介绍
杉木(Cunninghami a lanceolata (Lamb. ) Hook)隶属杉禾斗(Taxodiaceae)杉木属 (Curminghamia)，是我国特有的常绿针叶树种之一。杉木生长快，干形通直圆满，又以良好 的材性，美观的木材纹理著称，用途十分广泛，是我国重要的商品用材造林树种。自I960年 代以来，杉木良种选育研究，已培育出一大批优良种源、家系和优良无性系供造林使用，为 我国速生丰产林建设作出了重要贡献。但由于造林面积的迅速增加，社会上对杉木优良种 苗的需求极为迫切。然而由于近10多年来受到气候异常和杉木种实害虫的危害，杉木种子 园的种子产量，大小年的现象严重，良种种子产量和播种品质不稳定。杉木良种种苗的供应 不足，严重地制约着杉木人工林的发展。因此，有必要研发杉木优良种质资源的无性快速繁 殖。体细胞胚胎发生技术具有繁殖速度快，培养周期短，生产成本低等优势，这给解决杉木 优良种苗的繁育瓶颈和商业化和工厂化生产提供了技术支撑。被子植物体胚的发生和植株再生的思想，源于1902年Haberlandt提出的植物细 胞具有全能性的概念，即植物体的每一个细胞都具有发育成为一个新个体的潜在能力。在 人工培养条件下，植物体细胞可以诱导分化形成如有性生殖合子胚那样的胚状结构(胚状 体)，进而通过覆被人工胚乳形成人工种子或直接再生形成完整的植株。由于植物每一个体 细胞从理论上都存在诱导成胚的可能性，且繁殖速度快、不受地区、季节和灾害性气候等自 然条件的限制；对于木本植物来说，不必等待漫长的有性世代，也不必像常规的无性繁殖那 样需要充足的萌芽插条，一旦获得优良的材料，就可以比常规繁殖快数十倍甚至上百倍的 速度繁殖优良种苗。作为裸子植物的杉木，体胚的发生与被子植物的体细胞胚发生有着完全不同的途 径和机理，成熟的种子以及由种子发育而来的植株，营养细胞转变为胚性细胞十分困难。但 在针叶树种中，雌配子体受精后发育成种子的过程中有一部分珠心细胞处于未分化的阶 段，在适当的培养条件下，可以利用裂生多胚特性，诱导体胚形成。Gupta等(1985,1995) 报道过利用这一生物学特性，诱导出花旗松(Pseudotsuga menziesii)和湿地松(Pinus elliottii)的体胚，其大致可以分为四个步骤胚性胚柄细胞团(ESM :Embry0genesis suspensor mass)的诱导、保持和增殖、体胚的成熟、萌发和植株再生，并证明该技术体系具 有达到产业化的前景。目前虽有杉木成熟种子萌发后的下胚轴诱导体胚发生的报道，但是只能在外植体 上形成个别体细胞胚，存在诱导率低、数量少的问题，难以在生产上应用。国内外尚无利用 杉木优树未成熟种子诱导ESM、通过液体增殖ESM、并诱导体胚发生这一间接体胚发生途径 并实现植株再生的成功方法报道。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的是针对当前杉木组织培养器官发生困难、植株再生率低、 难以满足生产应用需要等问题，提供一种利用杉木优树的未成熟胚诱导胚性胚柄团形成， 进而实现体细胞胚发生和再生杉木植株的方法，以期实现能够快速生产大批高质量的苗 木，满足林业生产对优质杉木种苗的需求。技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下本专利技术以杉木优树未成熟胚为起始材料，在适宜的培养基上进行多步离体培养， 长期维持未成熟胚ESM的裂生多胚发生能力，经过胚性愈伤诱导、维持、增殖、体胚成熟前 期和成熟等阶段培养，获得体胚，再经萌发培养实现植株的再生。一种，包括以下步骤(1)杉木未成熟种子胚的准备每年的3月中旬前后，选择经后代测定表明优良的亲本，配置杂交组合。并于6月 中旬开始，采集杉木杂交组合的球果，在解剖镜下观察杉木合子胚的发育进程。取发育至胚 胎选择、优势胚、柱状胚和早期子叶胚阶段的杉木球果，迅速置于4°C条件下冷藏保存一周。 在无菌条件下，剥取球果中的未成熟种子胚备用；由于不同杉木生长的气候区不同和年度 间气象条件的变化，以解剖镜下观察到的胚胎选择阶段开始到早期子叶胚阶段为止均为合 适的球果取样时间。(2)ESM的起始诱导起始诱导阶段采用Gupta and Durzan基本培养基(DCR)基本培养。在无菌条件 下将未成熟种子胚接种至下述诱导固体培养基中，每个培养皿接种8粒种子胚，在23°C、暗 培养13 18天，就可以诱导获得大量ESM ；诱导固体培养基配方如下DCR基本培养基，附 加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)2 611^/1，6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 0. 5 lmg/L，6-呋喃氨 基嘌呤(KT)0. 5mg/L，维生素 C(Vc) 10mg/L，L-谷氨酰胺(L_Gln)0. 45g/L，水解酪蛋白 0. 5g/ L，肌醇0. lg/L，麦芽糖15g/L，活性炭(Ac) 2. 5g/L，水晶洋菜2. 3g/L。(3) EMS的维持与增殖维持与增殖阶段基本培养基采用DCR培养基。在无菌条件下，将(2)中诱导培养 所得的EMS转入维持固体培养基中，23 °C，暗培养20天；维持固体培养基的配方为DCR基本培养基，附加2，4-D 0. 5_2mg/L， 6-BAO. 2-0. 5mg/L, KT 0. 5mg/L, Vc lOmg/L,谷氨酰胺 0. 45g/L，水解酪蛋白 0. 5g/L，肌醇 0. lg/L，麦芽糖 20-25g/L，活性炭(Ac) 2. 5g/L，水晶洋菜 2. 5g/L。在无菌条件下，将维持培养20天后的EMS移入液体增殖培养基中，23 °C暗培养，摇 床转速为85-90r.p.m，增殖培养7天；液体增殖培养基配方为DCR基本培养基，附加2，4-D 0. 5-2mg/L，6-BA 0. 2mg/L, Vc 10mg/L，谷氨酰胺 0. 45g/L，水解酪蛋白 0. 5g/L，肌醇 2g/L， 麦芽糖30g/L。(4)体胚的成熟前期培养成熟前期培养阶段基本培养基采用DCR培养基。将(3)中所增殖培养完成后的EMS 转移到成熟前期液体培养基中，23°C，摇床转速为85r. p. m,暗培养7天，即可获得表面较为 致密的EMS ；成熟前期液体培养基配方为DCR基本培养基，附加脱落酸(ABA) 1、5或10mg/L,赤霉素(GA) 0. 1-lmg/L, Vc 10mg/L,谷氨酰胺0. 45g/L，水解酪蛋白0. 5g/L，肌醇5g/L，麦 芽糖30g/L。(5)体胚的成熟培养成熟培养阶段基本培养基采用DCR培养基。将(4)中经成熟前期培养的材料转移 到成熟培养基中，23°C，暗培养50天。成熟培养基配方为DCR基本培养基，附加ABA 3_8mg/ L，GA l-5mg/L，Vc 10mg/L，聚乙二醇(PEG 8000) 100_200g/L，谷氨酰胺 0. 45g/L，L_ 脯氨酸 (L-Pro)O. 2g/L，L-天冬氨酸(L-Asp) 0. 2g/L，水解酪蛋白 0. 5g/L，肌醇 5g/L，麦芽糖 30本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：（１）杉木未成熟种子胚的准备采集杉木杂交组合的球果，在解剖镜下观察杉木合子胚，取发育至胚胎选择、优势胚、柱状胚和早期子叶胚阶段的杉木球果，迅速置于４℃条件下冷藏保存一周。在无菌条件下，剥取球果中的未成熟种子胚备用；（２）ＥＳＭ的起始诱导在无菌条件下，将未成熟种子胚接种至诱导固体培养基中，每个培养皿接种８粒种子胚，控温２３℃、暗培养１３～１８天，诱导获得ＥＳＭ；其中，诱导固体培养基的配方为：ＤＣＲ为基本培养基，附加２，４－Ｄ ２～６ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ ０．５～１．０ｍｇ／Ｌ，ＫＴ ０．５ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ １０ｍｇ／Ｌ，Ｌ－Ｇｌｎ ０．４５ｇ／Ｌ，水解酪蛋白０．５ｇ／Ｌ，肌醇０．１ｇ／Ｌ，麦芽糖１５ｇ／Ｌ，Ａｃ ２．５ｇ／Ｌ，水晶洋菜２．３ｇ／Ｌ；（３）ＥＭＳ的维持与增殖在无菌条件下，将步骤（２）中诱导获得的ＥＭＳ转入维持固体培养基中，控温２３℃，暗培养２０天；其中，ＥＭＳ的维持固体培养基的配方为：ＤＣＲ基本培养基，２，４－Ｄ０．５－２ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ ０．２－０．５ｍｇ／Ｌ，ＫＴ ０．５ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ １０ｍｇ／Ｌ，谷氨酰胺０．４５ｇ／Ｌ，水解酪蛋白０．５ｇ／Ｌ，肌醇０．１ｇ／Ｌ，麦芽糖２０－２５ｇ／Ｌ，Ａｃ ２．５ｇ／Ｌ，水晶洋菜２．５ｇ／Ｌ；将维持培养２０天后的ＥＭＳ移入液体增殖培养基，控温２３℃，摇床转速为８５～９０ｒ．ｐ．ｍ，暗培养７天；其中，液体增殖培养基的配方为：ＤＣＲ基本培养基，２，４－Ｄ０．５－２ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ ０．２ｍｇ／Ｌ，Ａｃ １０ｍｇ／Ｌ，谷氨酰胺０．４５ｇ／Ｌ，水解酪蛋白０．５ｇ／Ｌ，肌醇２ｇ／Ｌ，麦芽糖３０ｇ／Ｌ；（４）体胚的成熟前期培养在无菌条件下，将步骤（３）中经增殖培养的ＥＭＳ转移到成熟前期液体培养基中，控温２３℃，摇床转速为８５ｒ．ｐ．ｍ，暗培养７天；其中，成熟前期液体培养基配方为：ＤＣＲ基本培养基，ＡＢＡ ５－１０ｍｇ／Ｌ，ＧＡ ０．１～１．０ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ １０ｍｇ／Ｌ，谷氨酰胺０．４５ｇ／Ｌ，水解酪蛋白０．５ｇ／Ｌ，肌醇５ｇ／Ｌ，麦芽糖３０ｇ／Ｌ；（５）体胚的成熟培养在无菌条件下，将步骤（４）中经成熟前期培养的材料转移到成熟培养基中，控温２３℃，暗培养３０天后，培养出长为４～５ｍｍ的子叶胚；其中，成熟培养基的配方为：ＤＣＲ基本培养基，ＡＢＡ ３－８ｍｇ／Ｌ，ＧＡ１－５ｍｇ／Ｌ，Ｖｃ １０ｍｇ／Ｌ，ＰＥＧ...
【技术特征摘要】
一种杉木体细胞胚胎发生及植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤(1)杉木未成熟种子胚的准备采集杉木杂交组合的球果，在解剖镜下观察杉木合子胚，取发育至胚胎选择、优势胚、柱状胚和早期子叶胚阶段的杉木球果，迅速置于4℃条件下冷藏保存一周。在无菌条件下，剥取球果中的未成熟种子胚备用；(2)ESM的起始诱导在无菌条件下，将未成熟种子胚接种至诱导固体培养基中，每个培养皿接种8粒种子胚，控温23℃、暗培养13～18天，诱导获得ESM；其中，诱导固体培养基的配方为DCR为基本培养基，附加2，4 D 2～6mg/L，6 BA 0.5～1.0mg/L，KT 0.5mg/L，Vc 10mg/L，L Gln 0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇0.1g/L，麦芽糖15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3g/L；(3)EMS的维持与增殖在无菌条件下，将步骤(2)中诱导获得的EMS转入维持固体培养基中，控温23℃，暗培养20天；其中，EMS的维持固体培养基的配方为DCR基本培养基，2，4 D0.5 2mg/L，6 BA 0.2 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，Vc 10mg/L，谷氨酰胺0.45g/L，水解酪蛋白0.5g/L，肌醇0.1g/L，麦芽糖20 25g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.5g/L；将维持培养20天后的EMS移入液体增殖培养基，控温23℃，摇床转速...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金慧，周小红，施季森，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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