【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫治疗，具体涉及一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白、一种新型肿瘤免疫抑制抵抗型car以及表达载体、免疫细胞和应用。
技术介绍
1、car全称是嵌合抗原受体，car-t是嵌合抗原受体t细胞即表达嵌合抗原受体(car)的t淋巴细胞，目前car-t治疗在血液系统肿瘤中取得了突破性进展，但在实体瘤中的效果不如血液系统瘤，其原因一方面因为car-t较难进入实体瘤内部，一方面即便car-t细胞进入实体瘤内部也因为肿瘤微环境而不能正常发挥功能，这些都影响car-t细胞在实体瘤治疗的疗效；肿瘤微环境与肿瘤的发生、生长和转移有着密切关系，近年来的临床研究表明，肿瘤微环境尤其是实体瘤的免疫微环境对免疫治疗(包含免疫细胞治疗)的疗效和预后都有着显著的影响。因此，car-t细胞治疗实体肿瘤，解决肿瘤微环境抑制即实施肿瘤微环境抵抗必不可少。
2、cd47作为继pd-1/pd-l1,ctla-4之后新的免疫检查点，通过向巨噬细胞传递“不要吃我”信号，抑制固有免疫的进行。目前有文献报道采用靶向cd47 scfv制备car-t进行肿瘤治疗。cd47可以促成肿瘤逃逸的免疫微环境，不过由于肿瘤的异质性，单独靶向cd47疗效有限，并且外源的scfv由于其强的亲和力可能会导致car-t细胞过度活化存续性差和非特异性引起安全隐患。因此，采用更安全有效的方案去识别cd47破除肿瘤微环境的逃逸信号十分重要。
3、信号调节蛋白α(sirpα)是cd47的配体之一，可与cd47结合，抑制巨噬细胞的吞噬作用，目前绝大多数关于cd47的研究均集中于
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种逆转肿瘤微环境的融合蛋白和包含该蛋白的表达载体和免疫细胞，所述融合蛋白可以逆转肿瘤微环境，靶向杀伤肿瘤细胞。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下方案：
3、对sirpγ蛋白的胞外段进行改造设计，得到可以破除肿瘤组织中抑制性信号的逆转肿瘤微环境的融合蛋白。
4、所述融合蛋白为sirpγ融合蛋白，所述sirpγ融合蛋白结构包含胞外段，跨膜区和胞内信号区。
5、进一步，跨膜结构来源于人cd28跨膜区或人cd8来源跨膜区。
6、进一步，所述跨膜结构氨基酸序列如seq id no:7或seq id no:8所示。
7、优选地，所述胞内信号区来源于cd28，序列如seq id no:9或seq id no:38所示。
8、进一步，所述sirpγ融合蛋白的结构为sirpγ-cd28tm-cd28、sirpγ-cd8tm-4-1bb。
9、进一步，所述sirpγ胞外段氨基酸序列如seq id no:1或其功能性变体所示。
10、进一步，所述sirpγ融合蛋白sirpγ-cd28tm-cd28的氨基酸序列为seq id no:2或其功能性变体所示。
11、进一步，所述sirpγ融合蛋白sirpγ-cd8tm-4-1bb的氨基酸序列为seq id no:3或其功能性变体所示。
12、进一步，所述sirpγ融合蛋白为sirpγ-cd28tm-cd28的核苷酸序列如seq id no:13所示。
13、进一步，所述sirpγ融合蛋白sirpγ-cd8tm-4-1bb的核苷酸序列如seq id no:14所示。
14、进一步，包含所述表达载体的免疫细胞。
15、进一步，所述免疫细胞为t细胞、t细胞前体或nk细胞。
16、具体的所述的t细胞可以是αβt细胞，也可以是γδt细胞；γδt细胞是一群表面含有受体γ和δ链的独特的t细胞亚群，占所有t淋巴细胞的0.5-5％，该细胞群于1987年首次发现。其虽然具有γδtcr，但是其识别抗原或配体为非mhc限制的，与传统的αβt细胞不同。目前已经有cn107810267a和cn107771215a等多篇专利公开将γδt细胞应用于细胞治疗和car-t细胞治疗中。
17、具体的，在设计sirpγ融合蛋白的同时还设计了pd-1的融合蛋白pd-1-28tm-28、pd-1-8tm-bb。
18、具体地，所述设计的sirpγ融合蛋白在与car1联合应用时，既可单独表达，也可以与car1共同表达发挥作用。并且所述sirpγ融合蛋白也可单独应用到免疫治疗中。
19、具体地，本专利技术中，专利技术人认为sirpγ蛋白更适合进行针对cd47进行肿瘤微环境破除的配体。因此，选择sirpγ蛋白的胞外段进行改造设计，并进一步设计肿瘤免疫抑制抵抗型的car；因此本专利技术创造性的将设计构建的缺氧可调控启动子联合car-t细胞技术和缺氧可调控启动子、sirpγ蛋白联合car-t细胞技术应用到肿瘤的免疫治疗当中，即进一步对传统的car结构进行改造，提高car-t在实体瘤上的治疗药效及car-t的安全性。
20、进一步，所述免疫细胞还包含具有识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体结构，所述嵌合抗原受体包含识别肿瘤抗原的胞外段、hinge区、跨膜区和胞内信号区，其中肿瘤抗原包含但不限于psca、psma、cd19、bcma、cd123、cd20、cd22、cea、egfr、egfrviii、gpc3、5t4、cd33、her2、gd2、cd70、cll-1、trop2、cd47、gpc3、clnd18.2、cd133、cs1、cd155、cd30、ror1、muc1、il13raα2或mesothelin等可以作为肿瘤靶向性识别的抗原分子。
21、本专利技术的目的在于还提供一种新型肿瘤免疫抑制抵抗型car，以及包含所述car的表达载体和免疫细胞。所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型car和免疫细胞破除肿瘤组织中抑制性信号对car-t功能的影响，实现了car-t治疗有效性，同时能够保证一定的安全性。
22、为实现上述目的，本专利技术采用以下方案：
23、所述新型肿瘤免疫抑制抵抗型car包含目的一所述的逆转肿瘤微环境的融合蛋白和car1，所述car1包含识别肿瘤抗原的胞外段、hinge区、跨膜区和胞内信号区。
24、进一步，所述融合蛋白通过多顺反子结构与car1连接，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点ires，所述自剪切多肽为t2a、p2a、e2a或f2a。
25、进一步，所述car的结构为scfv-hinge-tm-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ融合蛋白或scfv-hinge-tm-4-1bb-cd3ζ-自剪切肽-sirpγ融合蛋白。
26、进一步，所述car的结构为scf本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种免疫细胞，包含SIRPγ融合蛋白，其中，所述SIRPγ融合蛋白包含SIRPγ胞外段和任选的跨膜结构和胞内信号结构。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其包含具有识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述肿瘤抗原包含PSCA、PSMA、CD19、BCMA、CD123、CD20、CD22、CEA、EGFR、EGFRVIII、GPC3、5T4、CD33、Her2、GD2、CD70、CLL-1、Trop2、CD47、GPC3、CLND18.2、CD133、CS1、CD155、CD30、ROR1、MUC1、IL13RAα2或mesothelin。
4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫细胞，其中，表达所述融合蛋白和嵌合抗原受体的核酸通过相同载体或不同载体导入所述免疫细胞。
5.根据权利要求4所述的免疫细胞，其中，所述的载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体，RNA载体、质粒中的任一种。。
6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其中，所述融合蛋白胞
7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫细胞，其中，所述融合蛋白胞内信号结构来源于CD28或4-1BB。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫细胞，其中，所述免疫细胞为T细胞、T细胞前体或NK细胞。
9.包含权利要求1-8任一项所述的免疫细胞的药物组合物。
10.权利要求9所述的药物组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种免疫细胞，包含sirpγ融合蛋白，其中，所述sirpγ融合蛋白包含sirpγ胞外段和任选的跨膜结构和胞内信号结构。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其包含具有识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中，所述肿瘤抗原包含psca、psma、cd19、bcma、cd123、cd20、cd22、cea、egfr、egfrviii、gpc3、5t4、cd33、her2、gd2、cd70、cll-1、trop2、cd47、gpc3、clnd18.2、cd133、cs1、cd155、cd30、ror1、muc1、il13raα2或mesothelin。
4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫细胞，其中，表达所述融合蛋白和嵌合抗原受体的...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐艳敏，梅恩典，赵永春，单娟娟，齐亚男，赵文旭，陈军，黄霞，
申请(专利权)人：重庆精准生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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