本发明专利技术公开了人ＦＧＦ２１突变基因及制备重组人ＦＧＦ２１蛋白方法。本发明专利技术将人ＦＧＦ２１基因进行突变，突变后碱基序列为ＳＥＱ?ＩＤＮＯ．１所示，突变后的基因在原核细胞中的表达量有显著提高。本发明专利技术还提供了一种提高人ＦＧＦ２１蛋白表达量的方法，包括：将６×Ｈｉｓ标签基因、ＳＵＭＯ标签基因、羟胺切割位点基因和人ＦＧＦ２１突变基因依次连接在一起后得到ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ．３所示基因；将其与表达载体相连接，得到重组表达载体；将其转化宿主细胞；培养，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，羟胺切割，再纯化，即得。本发明专利技术方法具有特异性好、稳定性高、能在较宽范围的反应环境体系中保持切割活性、制备成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种突变基因，尤其涉及一种人FGF21突变基因以及由该基因编码 的人源成纤维细胞生长因子(hFGF21)，本专利技术还涉及该人FGF21突变基因在制备重组人 FGF21蛋白中的应用，属于人FGF21重组蛋白的制备领域。
技术介绍
2000年，Tetsuya Nishimura等最先报道了人FGF21基因。该基因定位于人α 1， 2-墨角藻糖基转移酶基因的5’侧翼区，编码一个209个氨基酸大小的多肽，特异性表达于 肝脏中，蛋白N端前28个氨基酸为信号肽，因此FGF21能分泌到细胞外。通过序列比对分 析，人FGF21属于FGF家族的FGF19亚家族，该家族包括FGF15、FGF19、FGF21、FGF23，FGF21 与家族中FGF19的同源性最高，两者氨基酸序列同源性为35%。由于FGF21与FGF19的同源性比较高，而后者已经证明可以调节内分泌代谢，因此 研究人员推测FGF21可能也具有相应的能力。2005年，来自Lilly公司的研究人员Alexei Kharitonenkov等首先在细胞水平和生物水平两方面对FGF21的生物学活性展开研究。他 们将FGF21作用于脂肪细胞24小时后发现，FGF21刺激后的脂肪细胞表现了明显葡萄糖 吸收能力，但与胰岛素的作用现象不同，在加入胰岛素刺激后，细胞很快出现葡萄糖吸收作 用，而FGF21则需要持续作用4小时以上才能达到相似的结果。同样的结果也在动物实验 上得到体现。而且FGF21还表现出一些很有意义的特点科研人员对健康鼠、糖尿病鼠及过 表达该基因的转基因小鼠的研究发现，任何剂量的FGF21均未引起小鼠体重增加或导致低 血糖症现象出现，这再一次提示FGF21可能不依赖于胰岛素途径来调节血糖。FGF21除直接调节血糖水平外，还可以激活胞外信号途径并改善胰腺细胞功能。据 报道，FGF21可以提高正常小鼠胰岛素mRNA水平和蛋白水平，同时激活细胞外信号调节激 酶1/2和Akt信号途径，但无诱导胰岛素分泌功能。FGF21处理的糖尿病啮齿动物，可以提 高胰岛素量和葡萄糖诱导胰岛素分泌。正常或糖尿病小鼠进行FGF21治疗后，胰岛素水平， 葡萄糖清除率都得到改善。而且未发现胰岛细胞增殖。由此推测，FGF21对胰腺的作用可 能得益于其在内环境稳定中起到的有益作用。另外，FGF21对糖脂毒性和细胞因子诱导的 胰岛细胞调亡也有局部保护作用。FGF21对血脂也有一定的调控作用。研究表明长期注射FGF21糖尿病恒河猴体内， 除血糖水平得到控制外，脂蛋白代谢也得到改善，尤其是特异性的降低低密度脂蛋白胆固 醇及升高高密度脂蛋白胆固醇水平，由此可见FGF21在整个内分泌过程中的重要作用。此外，Hajime Yamauchi等通过对斑马鱼FGF21的研究发现，敲除FGF21基因的斑 马鱼胚胎红细胞生成能力受到明显抑制，而该现象在向胚胎注入FGF21后得到改善。不仅 如此，缺少FGF21的斑马鱼胚胎在粒细胞的生成也受到干扰，因此FGF21可能在动物体内的 骨髓_红系祖细胞的分化中起到决定性作用。由于FGF家族成员大都具有促细胞分裂即促肿瘤生成的作用，而且，研究人员发 现与FGF21组成结构相似的FGF19会使小鼠肝细胞增生，因此FGF21安全性是决定它是否能够成为候选糖尿病药物的关键因素。令人兴奋的是，到目前为止，所有的实验都证明 FGF21是非常安全的。研究人员没有在被FGF21长期处理的3T3-L1细胞、NIH3T3细胞、人 脐静脉上皮细胞(HUVECs)等细胞上发现增殖现象，而且长期注射FGF21的小鼠、恒河猴及 转基因小鼠身上也没有任何组织增生现象。除了在糖尿病领域的研究外，FGF21还在其他几个方面给我们带来了振奋人心的 结果。Xinqiang Huang等利用二乙基亚硝胺作用于肝细胞大量表达FGF21的转基因小鼠， 令人惊奇的是与裸鼠相比，转基因小鼠能明显地延缓腺瘤的发生时间，虽然两者在肝癌发 生时间上并无太大区别，但是该结果也证明FGF21并不像FGF家族其他成员那样具有癌症 因子的恶名。作为肿瘤促进因子FGF家族的一员，FGF21同该家族的其他成员一样能够促使 MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)和FRS-2(成纤维生长因子受体底物2)的磷酸化，但是目前 的实验已经证明FGF21不会引起细胞分裂，因此FGF21信号传导途径引起众多科研人员的 兴趣。Alexei Kharitonenkov等对FGF21生物功能进行研究时发现，FGF21能够使 FGFR-I (成纤维细胞生长因子受体1)和FGFR-2 (成纤维细胞生长因子受体2)磷酸化，但 是这一过程并不需要肝磷脂的参与，这与以往对FGF家族成员的认识不符。而且FGF21只 能对脂肪细胞起作用而不能促进前脂肪细胞产生葡萄糖吸收作用，Yasushi Ogawa等通过 对不同分化时期的脂肪细胞研究发现beta-klotho在脂肪细胞分化过程中表达量从无到 有，因此推测beta-klotho的存在与否可能决定了 FGF21信号传递过程是否通畅，随后的试 验也证明了这一推断，免疫沉淀检测到FGF21受体复合物中包含了 beta-klotho，而且抑制 beta-klotho表达的脂肪细胞不能对FGF21的刺激起反应，因此beta-klotho取代肝磷脂参 与FGF21的信号传递过程。JULIE S. MOYERS等在对FGF21作用机制的研究中发现，PPAR γ (过氧化物酶体增 殖因子活化受体)激动剂罗格列酮能够增强FGF21刺激脂肪细胞葡萄糖吸收的能力，而且 进一步实验表明，在预先用罗格列酮处理脂肪细胞后，FGF21刺激FGFR-I和FGFR-2磷酸化 能力显著提高。由于大肠杆菌遗传背景清楚，繁殖快，成本低，表达量高，易于操作等诸多优势，目 前大多数重组蛋白的生产都是由大肠杆菌表达系统技术来实现。但其表达产物多为包涵 体，需要进行蛋白变性和复性，操作复杂，且蛋白损失量大，因此，有必要摸索FGF21在大肠 杆菌中大量可溶性表达的条件，为FGF21研制成药物奠定基础。目前，大肠杆菌表达系统多用目的蛋白与相应的标签进行融合表达，以利于纯化。 现有的用于从融合蛋白中切割标签的蛋白酶或蛋白因子主要存在着特异性较差、稳定性 低、不能在较宽范围的反应环境体系中保持高活力等缺陷，更为重要的是其成本高，因此， 在工业化生产中成为一个制约因素，有待进一步改进。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种人FGF21突变基因，该突变基因能显著提高人FGF21 蛋白的可溶性表达量。本专利技术目的之二是提供一种由上述人FGF21突变基因编码的蛋白。本专利技术目的之三是提供一种制备重组人FGF21蛋白的方法。本专利技术上述目的是通过以下技术方案来实现的一种人FGF21突变基因(mutFGF21)，其碱基为SEQ ID NO. 1所示；由上述人FGF21突变基因编码的蛋白，其氨基酸为SEQ ID NO. 2所示；本专利技术将人FGF21基因进行了突变，相比于突变前，突变后的人FGF21基因在宿主 细胞中的可溶性表达量有显著提高。含有SEQ ID NO. 1所示碱基的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞也当然的 包括在本专利技术的保护范畴之内。其中，所述的表达载体优选为原核表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人ＦＧＦ２１突变基因，其特征在于：其碱基为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
一种人FGF21突变基因，其特征在于其碱基为SEQ IDNO.1所示。2.由权利要求1所述人FGF21突变基因所编码的蛋白，其特征在于其氨基酸为SEQ ID NO. 2 所示。3.含有权利要求1所述人FGF21突变基因的表达载体。4.按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述表达载体是原核表达载体。5.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。6.一种制备重组人FGF21蛋白的方法，包括将权利要求1所述人FGF21突变基因与 表达载体可操作性的相连接，得到重组表达载体；将重组表达载体转化宿主细胞；培养重 组宿主细胞，诱导重组蛋白表达，收集并纯化所表达的蛋白，即得。7.一种制备重组人FGF21蛋白的方法，包括将6XHis标签基因、SUMO标签基因、羟 胺切割位点基因和权利要求1所述人FGF21突变基因依次连接在一起后得到SEQ ID NO....
【专利技术属性】
技术研发人员：任桂萍，李德山，高华山，刘铭瑶，王文飞，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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