本发明专利技术涉及一种模拟病毒，特别涉及ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ重组模拟病毒及其制备方法和应用，该模拟病毒为融合多肽与ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ重组表达载体的复合物，其中融合多肽由ＲＧＤ肽与穿膜肽ＨＩＶ－Ｔａｔ４９－５７连接而成，ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ的表达；该模拟病毒可以靶向肝癌细胞并使ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的ＦＡＴ１０基因表达沉默，避免损伤无关细胞，同时还具有转染效率高、制备方法简单省时等优点，可用于制备抗肝癌药物，在肝癌基因治疗领域有着良好的开发应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种模拟病毒，特别涉及FATlO基因siRNA重组模拟病毒，还涉及该模 拟病毒的制备方法和应用。
技术介绍
肝癌是常见的恶性肿瘤，位居恶性肿瘤发病率的第5位，其确切发病机制尚未完 全明了。如何阻断慢性肝脏疾病向肝癌的恶性转化，或在肝癌早期加以干预，成为进一步提 高肝癌治疗效果的关键。FATlO又被称为双泛素(diubiquitin)，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白 (UBLs)，是一个分子量为ISkDa的包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融 合而成。FATlO在细胞周期的调控中起到十分重要的作用，已被证明能与人纺锤体聚集检测 点蛋白(mitotic arrest deficiency 2,MAD2)非共价结合。MAD2负责在有丝分裂时保持 纺锤体的完整性，其功能受到抑制将导致染色体不分离或染色体不稳定，这是许多肿瘤发 生的重要特征。已有研究发现，FATlO在肝癌、宫颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌及小肠腺癌 等恶性肿瘤中表达均明显上调，表明FATlO在恶性肿瘤的发生中起到一定作用。因此，抑制 FATlO的过度表达，可能是调控肝癌基因表达的新途径。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指内源性或外源性双链 RNA(doublestranded RNA, dsRNA)引发生物体内同源mRNA降解从而表现出的基因转录后 沉默现象，现已成为分子生物学家分析基因组功能和基因治疗的一个有力工具。小干扰 RNA(small interference RNA, siRNA)是RNAi的效应分子，是一类长21 23个核苷酸 的双链RNA，在体内可特异性降解与其序列互补的mRNA而引发基因沉默。文献(刘天德 等.siRNA对肝癌细胞异常表达FATlO基因的抑制效应研究.新医学，2009，40 (6) 358)报 道了 FATlO基因siRNA可以抑制人肝癌细胞株H印3B中FATlO基因的表达，并抑制Hep3B 细胞的生长。但该文献使用的是体外合成的siRNA，而siRNA在体内易被核酸酶降解，稳定 性较差，产生的RNAi干扰效应时间短，不适用于长期基因沉默。最好是借助表达质粒或病 毒载体等在细胞内持续产生siRNA，例如将编码短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA)的 模板DNA序列插入载体启动子后构建重组表达载体，所得重组表达载体导入体内后持续转 录出shRNA，shRNA再被体内RNaseIII家族的内切核酸酶Dicer剪切成siRNA，从而达到长 期抑制靶基因表达的目的。虽然病毒载体介导的RNAi近年来受到人们重点关注，利用病毒 载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，但其也存在 诸如免疫原性和病毒性重组等安全性问题，以及制备过程复杂、容量有限、制得的病毒滴度 较低等缺陷。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种FATlO基因siRNA重组模拟病毒，可 以靶向肝癌细胞并使FATlO基因siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的3FATlO基因表达沉默，避免损伤无关细胞。为达到上述目的，本专利技术的FATlO基因SiRNA重组模拟病毒为融合多肽与FATlO 基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV-Tat49-57连接而 成；所述FATlO基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白(AFP)启动子控制FATlO基因siRNA 的表达。进一步，所述融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；进一步，所述FATlO基因siRNA的核苷酸序列为正义链如SEQ ID No. 1所示，反 义链如SEQ ID No. 2所示；进一步，所述FATlO基因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQID No. 3 和SEQ ID No. 4所示的2条模板DNA单链经退火处理后插入pSilencerl. 0-U6载体的启动 子之后而得到；所述pSilencer 1. 0-U6载体中的U6启动子被AFP启动子所替换。RGD肽是一类含有Arg-Gly-Asp (RGD)序列的小肽，广泛存在于多种生物体内及同 一种生物体的各种组织中。作为一种重要的细胞识别位点与信号启动分子，RGD肽在许多 生命活动中发挥着重要的调节作用。目前研究较多的是关于RGD肽通过其所含的RGD序列 竞争结合到细胞表面的整合素受体上从而产生抗血小板凝聚、抗肿瘤迁移以及抗肿瘤血管 生成作用等方面。研究证实整合素家族中α β 3与细胞粘附和新生血管形成的关系最为 密切，其配体R⑶肽对肿瘤新生血管内皮细胞的粘附和迁移有明显抑制作用，且可诱导肿 瘤细胞中caspase-3和caspase-7表达增高，从而促进肿瘤细胞的凋亡。本专利技术将RGD肽 与阳离子穿膜肽HIV-Tat49-57连接构成富含正电荷的融合多肽，利用正负电荷吸引原理， 该富含正电荷的融合多肽可以包装富含负电荷的FATlO基因siRNA重组表达载体，形成小 而均勻的颗粒性肽-DNA复合物。这种颗粒模拟了天然病毒的结构，故称其为模拟病毒。本 专利技术的融合多肽具有穿膜肽HIV-Tat49-57的穿膜活性，易于被抗原递呈细胞摄取，体内转 染效率高；同时，通过RGD肽与肝癌细胞及新生血管内皮细胞表面整合素受体的特异性结 合，可以引导模拟病毒靶向定位到肝癌细胞，达到杀伤肝癌细胞而不损害正常细胞的治疗 目的，大大提高肝癌基因治疗的安全性和有效性，此外RGD肽本身也具有抗肿瘤迁移和抗 肿瘤血管生成的作用，并能诱导肿瘤细胞的凋亡。以本专利技术的融合多肽为核酸载体，还具有 无蓄积危害性和传染性，核酸容量无限制，制备方法简便等优点。本专利技术的RGD肽序列优选 为RGDRGDRGD，即将三个RGD序列串联，其能够有效提高RGD肽的靶向能力。 目的基因的靶向性表达对肝癌的治疗极其重要。AFP是一种大分子糖蛋白，主要由 胎儿肝细胞和卵黄囊产生。当胎儿出生后，AFP的合成逐渐停止，但当肝细胞发生癌变时， 这种胚胎抗原的基因被激活，可重新产生大量的AFP。研究发现，约60% 70%的肝癌患者 血清AFP水平升高。因此，AFP启动子具有肝癌细胞特异性，可启动外源基因在肝癌细胞中 的特异性表达。在本专利技术中，以AFP启动子调控FATlO基因siRNA的表达，可使FATlO基因 siRNA局限在肝癌细胞中表达，特异性导致肝癌细胞中的FATlO基因表达沉默，从而实现了 基因治疗的靶向性，避免了对其它器官的不良反应。本专利技术的目的之二在于提供所述FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，操 作简便，耗时少。为达到此目的，本专利技术所述FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，包括以下 步骤a、采用化学合成法合成氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示的融合多肽；b、构建FATlO基因siRNA重组表达载体以人肝癌细胞株H印G2的基因组DNA为 模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下游引物通过PCR扩 增获得AFP启动子片段，经限制性内切酶KpnI和ApaI双酶切后，与同样经KpnI和ApaI双 酶切去除U6启动子的pSilencer本文档来自技高网...
【技术保护点】
ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ重组模拟病毒，其特征在于：该模拟病毒为融合多肽与ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ重组表达载体的复合物；所述融合多肽由ＲＧＤ肽与穿膜肽ＨＩＶ－Ｔａｔ４９－５７连接而成；所述ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制ＦＡＴ１０基因ｓｉＲＮＡ的表达。
【技术特征摘要】
FAT10基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于该模拟病毒为融合多肽与FAT10基因siRNA重组表达载体的复合物；所述融合多肽由RGD肽与穿膜肽HIV Tat49 57连接而成；所述FAT10基因siRNA重组表达载体通过甲胎蛋白启动子控制FAT10基因siRNA的表达。2.根据权利要求1所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于所述融合多 肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示。3.根据权利要求1或2所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于所述 FATlO基因siRNA的核苷酸序列为正义链如SEQ ID No. 1所示，反义链如SEQ ID No. 2所不。4.根据权利要求3所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒，其特征在于所述FATlO基 因siRNA重组表达载体是将核苷酸序列分别如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的2条模板 DNA单链经退火处理后插入pSiIencer 1. 0-U6载体的启动子之后而得到；所述pSiIencer 1. 0-U6载体中的U6启动子被甲胎蛋白启动子所替换。5.权利要求1所述的FATlO基因siRNA重组模拟病毒的制备方法，其特征在于a、采用化学合成法合成氨基酸序列如SEQID No...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨曌，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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