【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、蛋白水解平衡的调节异常通常与疾病相关，并且可以指示包含癌症、自身免疫性疾病、炎症和其它疾病在内的疾病进展。蛋白水解是一种不可逆的调节机制，并且已知选择性地切割特异性底物。这些肽底物的鉴定已成为推动用于早期疾病检测的生物标志物的开发和用于更安全的癌症疗法的新药物设计的有力工具。例如，许多蛋白酶参与细胞死亡和组织重塑上游的过程，所述细胞死亡和组织重塑最终导致疾病负担，这从而产生了用于通过利用如pet探针等细胞毒性蛋白酶颗粒酶b(gzmb)和尿液生物标志物来进行早期癌症检测的基于活性的策略。另外，癌症治疗的不期望的中靶/脱肿瘤毒性与大多数临床应答有关。这种毒性激发了几种被设计为前药、前体、掩蔽细胞因子和t细胞双特异性的癌症疗法，所述前药、前体、掩蔽细胞因子和t细胞双特异性在非靶标器官中被屏蔽，并且可在存在肿瘤相关蛋白酶的情况下激活。鉴于蛋白酶活性用于诊断性和治疗性应用的用途，需要通过开发用于筛选和鉴定在实际病理部位中被蛋白酶选择性地切割的底物的策略来解决以上提到的前述问题。
技术实现思路
1、本公开涉及经工程化的蛋白酶激活型受体以及其制造方法和用途。
2、一方面，本文中公开了经工程化的蛋白酶激活型受体，其包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域；其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。在其它实施例中，所述经工程化的受体包括嵌合抗原受体(car)或合成notch(synnotch)受体。
3、此外，公开了根据前述
4、在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个氨基酸。在一个实例中，在一些方面中，所述掩蔽肽包括seq id no:1-4。在另一个实例中，所述掩蔽肽包括her2肽。
5、本文中还公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。在一些实施例中，所述连接肽包括蛋白酶切割型肽。在其它实施例中，所述蛋白酶切割型肽包括seq id no:5-7。
6、在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中信号转导复合物包括cd8α信号传导肽、细胞外notch核和膜旁notch核。在一些实施例中，所述cd8α信号传导肽包括seq id no:8或seq id no:9。在其它实施例中，所述细胞外notch核包括seq id no:10或seq id no:11。在一些实施例中，其中所述膜旁notch核包括seq id no:12。
7、本文中还公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜结构域为跨膜notch核。在一些实施例中，所述跨膜notch包括seq id no:13或seq id no:14。
8、在一些方面中，本文中公开了根据前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞内转录因子激活报告基因。在一些实施例中，所述转录因子包括gal4-vp64转录因子。在一些实施例中，所述报告基因包括荧光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、青色荧光蛋白(cfp)、单体红色荧光蛋白(mrfp)、海葵(discosoma striata)(dsred)、mcherry、morange、tdtomato、mstrawberry、mplum、光激活型gfp(pa-gfp)、venus、kaede、单体kusabira orange(mko)、dronpa、增强型cfp(ecfp)、emerald、用于能量转移的青色荧光蛋白(cypet)、超级cfp(scfp)、cerulean、光切换型cfp(ps-cfp2)、光激活型rfp1(pa-rfp1)、光激活型mcherry(pa-mcherry)、单体蓝绿色荧光蛋白(mtfp1)、eos荧光蛋白(eosfp)、dendra、tagbfp、tagrfp、增强型yfp(eyfp)、topaz、citrine、用于能量转移的黄色荧光蛋白(ypet)、超级yfp(syfp)、增强型gfp(egfp)、superfolder gfp、t-sapphire、fucci、mko2、morange2、mapple、sirius、azurite、ebfp、ebfp2、单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(hsv-tk)和/或碘化钠同向转运体(nis)。
9、本文中公开了免疫细胞，其包括前述方面中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体。在一些实施例中，所述免疫细胞为t细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤(nk)细胞或nk t细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括蛋白酶底物文库。在一些实施例中，所述文库包括随机3个、4个、5个或6个氨基酸肽。
10、本文中还公开了一种筛选各种各样的蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶的体外方法，所述方法包括：a.将表达靶抗原的癌样品与以下一起培养：i)免疫细胞，所述免疫细胞包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内转录因子；其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、蛋白酶底物、抗原结合受体和信号转导复合物；以及ii)蛋白酶；其中作为所述蛋白酶的特异性靶标的底物被所述蛋白酶切割；并且其中所述蛋白酶底物的切割使得去除所述掩蔽肽，由此允许所述抗原结合受体与所述癌样品上的所述靶抗原结合；其中所述抗原结合受体与所述靶抗原的结合使所述信号转导复合物表达报告基因；以及b.检测报告基因的表达。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过测序鉴定所述蛋白酶底物的序列。在其它实施例中，所述方法进一步包括连续进行所述筛选2次、3次、4次或5次，并且每个后续次仅使用来自前一轮次的序列的前10％。
11、在一些方面中，本文中公开了一种根据前述方面中任一项所述的筛选各种各样的蛋白酶底物以监测癌症中的失调的蛋白酶的体外方法，其中所述蛋白酶底物文库中的任一者包括3个、4个、5个或6个随机氨基酸接头。...
【技术保护点】
1.一种经工程化的蛋白酶激活型受体，其包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。
2.根据权利要求1所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为细胞外表面受体。
3.根据权利要求1或2所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述经工程化的受体包括合成Notch(synNotch)受体或嵌合抗原受体(CAR)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为包括SEQ ID NO:27的抗人表皮生长因子受体2(αHER2)scFv受体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为抗表皮生长因子受体(αEGFR)scFv受体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9-21个氨基酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9个氨基酸。
8
9.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为11个氨基酸。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为12个氨基酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽包括SEQ ID NO:1-4。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽包括αHER2肽或αEGFR肽。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为5-40个氨基酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为6个氨基酸。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为7个氨基酸。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为8个氨基酸。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为9个氨基酸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽包括蛋白酶切割型肽。
19.根据权利要求18所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述蛋白酶切割型肽包括SEQ ID NO:5-7。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述信号转导复合物包括CD8α信号传导肽、细胞外Notch核和膜旁Notch核。
21.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述CD8α信号传导肽包括SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。
22.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞外Notch核包括SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
23.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述膜旁Notch核包括SEQ ID NO:12。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜结构域为跨膜Notch核。
25.根据权利要求24所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜Notch核包括SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞内转录因子激活报告基因。
27.根据权利要求26所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述转录因子包括Gal4-VP64转录因子，所述Gal4-VP64转录因子包括SEQ ID NO:28。
28.根据权利要求26所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述报告基因包括CD69、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、单体红色荧光蛋白(mRFP)、海葵(Discosoma striata)(DsRed)、mCherry、mOrange、tdTomato、mStrawberry、mPlum、光激活型GFP(PA-GFP)、Venus、Kaede...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经工程化的蛋白酶激活型受体，其包括细胞外传感器、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述细胞外传感器进一步包括掩蔽肽、连接肽、抗原结合受体和信号转导复合物。
2.根据权利要求1所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为细胞外表面受体。
3.根据权利要求1或2所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述经工程化的受体包括合成notch(synnotch)受体或嵌合抗原受体(car)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为包括seq id no:27的抗人表皮生长因子受体2(αher2)scfv受体。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述抗原结合受体为抗表皮生长因子受体(αegfr)scfv受体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9-21个氨基酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为9个氨基酸。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为10个氨基酸。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为11个氨基酸。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽的长度为12个氨基酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽包括seq id no:1-4。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述掩蔽肽包括αher2肽或αegfr肽。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为5-40个氨基酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为6个氨基酸。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为7个氨基酸。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为8个氨基酸。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽的长度为9个氨基酸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述连接肽包括蛋白酶切割型肽。
19.根据权利要求18所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述蛋白酶切割型肽包括seq id no:5-7。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述信号转导复合物包括cd8α信号传导肽、细胞外notch核和膜旁notch核。
21.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述cd8α信号传导肽包括seq id no:8或seq id no:9。
22.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞外notch核包括seq id no:10或seq id no:11。
23.根据权利要求20所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述膜旁notch核包括seq id no:12。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜结构域为跨膜notch核。
25.根据权利要求24所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述跨膜notch核包括seq id no:13或seq id no:14。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述细胞内转录因子激活报告基因。
27.根据权利要求26所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述转录因子包括gal4-vp64转录因子，所述gal4-vp64转录因子包括seq id no:28。
28.根据权利要求26所述的经工程化的蛋白酶激活型受体，其中所述报告基因包括cd69、荧光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、青色荧光蛋白(cfp)、单体红色荧光蛋白(mrfp)、海葵(discosoma striata)(dsred)、mcherry、mo...
【专利技术属性】
技术研发人员：G·A·邝，M·甘博亚，Q·麦克，H·普恩戈哈姆，A·西瓦库马尔，A·扎马特，
申请(专利权)人：乔治亚技术研究公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。