一种植物酪氨酸酶的染色方法技术

本发明专利技术涉及一种植物酪氨酸酶的染色方法，该方法是先提取植物的酪氨酸酶后进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，电泳后的凝胶板放入含有Ｌ－多巴、３－甲基－２－苯并噻唑啉酮腙、过氧化氢酶和二甲基甲酰胺的染色液中染色，直到凝胶板棕色反应带清晰出现后用清水冲洗终止显色反应，棕色带即为酪氨酸酶反应带。该种方法程序简单，对仪器设备要求不高，染色专一性强，而且可以确定酪氨酸酶的大致分子量，结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物化学

技术介绍
酪氨酸酶是植物中甜菜素合成和动物体内黑色素合成的关键酶，具有羟化和氧化 双重活性。目前，对酪氨酸酶活性测定的研究很多，但对其活性染色的报道不多。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物酪氨酸酶的活性染色方法，该种方法程序简单，对 仪器设备要求不高，染色专一性强，结果准确可靠。本专利技术采用的技术方案是植物酪氨酸酶的染色方法，包括如下步骤(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶按照料液比1 5 10 (w/v)加入60mmol Γ1磷酸缓冲液(pH 5. 7)于冰浴研磨，缓冲液包含0. 5mol L^1NaCl, IOmmol L-1抗坏血酸， 10 μ Iiioir1CuCl2和2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。研磨液以8000 IOOOOg于4°C离心15 30分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于-70°C保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度12%，每个泳道加样20 30μ L酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并 且不用沸水煮以保持蛋白质活性。(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L—1 磷酸缓冲液(PH6. 8))中平衡10 20分钟。然后转移到IOOml染色反应液中染色30 60 分钟，染色液成分是磷酸缓冲液(pH6.8)包含5mmol L4L-多巴，4mmol 甲基-2-苯并 噻唑啉酮腙，50 μ gmL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。凝胶板棕色反应带清晰出 现后用清水冲洗终止显色反应，棕色带即为酪氨酸酶反应带。本方法的有益效果程序简单，对仪器设备要求不高，染色专一性强，而且可以确定 酪氨酸酶的大致分子量，结果准确可靠。附图说明图1盐地碱蓬酪氨酸酶电泳后的凝胶板染色30分钟出现的棕色带(椭圆内)图2盐地碱蓬酪氨酸酶电泳后的凝胶板染色60分钟出现的棕色带(椭圆内)具体实施例方式实施例1(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶2克，加入IOmL 60mmol L—1磷酸缓冲液 (pH 5.7)于冰浴研磨，缓冲液包含 0. 5mol L^1NaCl, IOmmol Γ1 抗坏血酸，10 μ mol [1CuCl2 和2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。研磨液以SOOOg于4°C离心15分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于-70°C保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度12%，每个泳道加样20 μ L酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不 用沸水煮以保持蛋白质活性。 (3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L—1 磷酸缓冲液(PH6. 8))中平衡10分钟。然后转移到IOOml染色反应液中染色30分钟，染色 液成分是磷酸缓冲液(PH6. 8)包含5mmol IZ1L-多巴，4mmol Ll-甲基-2-苯并噻唑啉酮 腙，50 μ g mL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。用清水冲洗凝胶板终止显色反应， 如图1所示凝胶板上出现的清晰棕色条带即为酪氨酸酶反应带。实施例2(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶2克，加入20mL 60mmol L—1磷酸缓冲液 (pH 5.7)于冰浴研磨，缓冲液包含 0. 5mol L^1NaCl, IOmmol Γ1 抗坏血酸，10 μ mol [1CuCl2 和2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)。研磨液以IOOOOg于4°C离心30分钟，上清液即为酪氨酸酶 提取液，于_70°C保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，浓缩胶浓度 4%，分离胶浓度12%，每个泳道加样30 μ L酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不 用沸水煮以保持蛋白质活性。(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L—1 磷酸缓冲液(PH6.8))中平衡20分钟。然后转移到100ml染色反应液中染色60分钟，染色 液成分是磷酸缓冲液(PH6. 8)包含5mmol IZ1L-多巴，4mmol Ll-甲基-2-苯并噻唑啉酮 腙，50 μ g mL—1过氧化氢酶，2% N，N' -二甲基甲酰胺。用清水冲洗凝胶板终止显色反应， 如图2所示凝胶板上出现清晰的棕色条带即为酪氨酸酶反应带。本文档来自技高网...

【技术保护点】
植物酪氨酸酶的染色方法，其特征是包括如下步骤：　　（１）酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶按照料液比１∶５～１０（ｗ／ｖ）加入６０ｍｍｏｌ　Ｌ－１磷酸缓冲液（ｐＨ　５．７）于冰浴研磨，研磨液以８０００～１００００ｇ于４℃离心１５～３０分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于－７０℃保存备用。　　（２）取（１）中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，每个泳道加样２０～３０μＬ酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不用沸水煮以保持蛋白质活性。　　（３）取（２）中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入６０ｍｍｏｌ　Ｌ↑［－１］磷酸缓冲液（ｐＨ６．８））中平衡１０～２０分钟。然后转移到１００ｍｌ染色反应液中染色３０～６０分钟，染色液成分是磷酸缓冲液（ｐＨ６．８）包含５ｍｍｏｌ　Ｌ↑［－１］Ｌ－多巴，４ｍｍｏｌ　Ｌ↑［－１］３－甲基－２－苯并噻唑啉酮腙，５０μｇ　ｍＬ↑［－１］过氧化氢酶，２％Ｎ，Ｎ′－二甲基甲酰胺。凝胶板棕色反应带清晰出现后用清水冲洗终止显色反应，棕色带即为酪氨酸酶反应带。

【技术特征摘要】
植物酪氨酸酶的染色方法，其特征是包括如下步骤(1)酪氨酸酶提取，取盐地碱蓬幼苗幼叶按照料液比1∶5～10(w/v)加入60mmol L 1磷酸缓冲液(pH 5.7)于冰浴研磨，研磨液以8000～10000g于4℃离心15～30分钟，上清液即为酪氨酸酶提取液，于 70℃保存备用。(2)取(1)中所得酪氨酸酶提取液进行聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳，每个泳道加样20～30μL酪氨酸酶提取液，样品中不加巯基乙醇并且不用沸水煮以保持蛋白质活性。(3)取(2)中电泳后的凝胶板进行酪氨酸酶的活性染色，将凝胶板放入60mmol L 1磷酸缓冲液(pH6.8))中平衡10～20分钟。然后转移到100ml染色反应液中染色30～60分钟，染色液成分是磷酸缓冲液(pH6.8)包含5mmol L 1L 多巴，4mmol L 13 甲基 2 苯并噻...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长泉，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]