小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法技术

一种小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法，（１）将小蓬竹生长健壮的半木质化枝条作外植体，用１％洗洁精溶液完全浸泡３０ｍｉｎ，（２）用自来水浸泡３０ｍｉｎ；（３）用流水冲洗至无泡沫产生为止，用滤纸吸干表面水分；（４）在超净工作台上把已冲洗干净的外植体浸入７０－７５％酒精中消毒１ｍｉｎ；（５）用无菌水浸泡不断摇动冲洗３～４次；（６）最后浸入０．１％升汞或２％次氯酸钠溶液灭菌６－１２ｍｉｎ，其间不断摇动；（７）然后用无菌水冲洗后，用无菌滤纸吸干表面水分，即可用于接种。本发明专利技术填补了小蓬竹组织培养快速繁殖的空白，为小蓬竹的园林栽种、大面积绿化、喀斯特石漠化的恢复，奠定了迅速且充足供应的基础，为小蓬竹的工厂化大规模生产提供了可行的方案。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于竹类组织培养技术，具体地说是涉及一种小蓬竹组织培养过程中外植 体的消毒方法。
技术介绍
^bMYi (Drepanostachyum Luodianense (Yi et R. S. Wang) Keng f. ) Μ^^^Υ 亚科镰序竹属竹种，又名“藤竹”，是中国特有种，在《中国物种红色名录》中被列为极危种。 目前只在贵州的罗甸、平塘及长顺有栽培或有野生分布，常成片生长于海拔600 IOOOm的 石灰岩裸露石山上。它的竹材柔韧可编凉椅和农具，也可作为造纸原料；形态优美，是良好 的园林绿化竹种，并在环境恶劣的喀斯特地区生长良好，能耐干旱和瘠薄，对增强土壤的固 土、保水、保肥能力效果十分显著，是喀斯特地区的适生性物种，在喀斯特生态系统中对水 源涵养、水土保持、养分平衡等生态功能发挥着重要作用，具有很高的生态效益。竹类的生殖周期长，很少开花结实，难以获得大规模繁殖的种子。而传统的移竹、 埋鞭、竹枝扦插等繁殖方法存在消耗种竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等问 题。采用组织培养的方法效率高，条件可控，生长快，周期短，重复性强，可进行周年试验或 生产等优点，可以快速繁殖苗，适合竹子的工厂化百苗。迄今为止，国内外竹子组织培养工作取得了很大的进展，但还是存在着许多的问 题，如何通过有效的消毒方法降低外植体的污染率，就是需要首先解决的问题。与其他植物 相比，竹子外植体消毒这一环节较为困难，很难达到理想的灭菌效果。这与竹类植物的特殊 形态结构有关。竹类植物的表皮细胞具有致密的乳突及较厚的角质层，乳突表面蜡质状的 物质及乳突间嵌附着的尘埃和各种菌类的孢子等，均阻碍了消毒液的渗透，从而影响外植 体的充分灭菌。若选用杆芽、枝芽做外植体，中空坚硬的竹秆也导致外植体切割困难，细菌 和真菌孢子容易从中空部位进入竹秆内部组织，造成后续污染。在外植体消毒时，消毒时间 的控制也是一个重要问题，时间太短不能杀死细菌病毒，时间太长在杀死病菌的同时也会 对植物造成伤害，引起褐变，影响外植体的诱导与增殖。因此，寻找有效的灭菌方法，减少污 染瓶的丢弃，对于降低种苗生产成本和实现工厂化生产具有很重要的意义。目前国内对小蓬竹研究最多的是小蓬竹的群落结构、多样性、水土保持功能、土壤 种子库、叶面积指数以及其栽培技术研究应用等领域，而在组织培养方面尤其是外植体消 毒方法的研究还是空白。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种小蓬竹组织培养过程中的一个重要环节， 即外植体的消毒方法，以克服小蓬竹繁殖困难，和组织培养过程中成活率低的问题。植物组织培养通常按以下步骤一、培养基的配制和灭菌本专利技术实验所用培养基为通用的MS培养基，培养基配 制后在24h内必须进行灭菌，通常采用的灭菌方法为高压灭菌法，其原理是通过加热，在密闭的高压锅内随着水蒸气压力的不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之升尚ο二、外植体的处理及消毒消毒的目标是既要消灭材料上的病菌，又不损伤植物材料。三、外植体的接种无菌操作实验室中使用的无菌操作设备是超净工作台。接种前应进行地面的清洁 卫生工作，用75%乙醇喷雾喷洒接种室，擦拭超净工作台台面，培养皿、酒精灯和其他工具 也要事先放在超净工作台上，一起用紫外灯照射20min。操作前要用酒精擦洗手，操作中要 经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免口腔中所带的微生物污染材 料、培养基和用具。操作中可采用250或500mL的广口瓶，放入95%的酒精，以便对操作工 具进行消毒。在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒 精灯火焰上灼烧灭菌。灼烧接种工具，待冷却后在酒精灯附近打开培养基瓶口，立即将所取 的外植体迅速置入固体培养基中。在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接， 减少伤口在空气中暴露的时间。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上 烧一下，然后盖上。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。四、植物组织培养培养条件为光照强度1200LX，每日光照12h，温度25 27°C。从接种完起每天 观察其生长和污染情况，30天后记录结果，统计其污染数、成活数，进行分析得出最佳方案。植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植 体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细 胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织或细胞，根据工作中的不同材料 采制适宜的外植体。消毒是植物组织培养的一个重要环节，在自然条件下作为植物的外植 体材料，不管内部还是外部均带有很多的细菌和霉菌。因此为了让外植体能够在无菌的条 件下生长，消毒成了组织培养一个必不可少的步骤。消毒的目标是既要消灭材料上的病 菌，又不损伤植物材料。因此一方面要考虑药剂对各类菌类的杀灭效果，从中选出最有效的 杀菌剂；另一方面，还应考虑植物材料对杀菌剂的忍耐力。使用什么药剂、处理时间，要根据 植物材料种类和取用的部位进行试验。本专利技术根据小蓬竹的特点，在实验的基础上，提出小蓬竹外植体的消毒方法，选择 了最有效的杀菌剂，并根据小蓬竹材料对杀菌剂的忍耐性实验出药剂浓度和处理时间。本专利技术外植体的消毒方法，其消毒流程按下列步骤进行(1)将小蓬竹生长健壮 的半木质化枝条作外植体，用洗洁精溶液完全浸泡30min，(2)用自来水浸泡30min ； (3) 用流水冲洗至无泡沫产生为止，用滤纸吸干表面水分；(4)在超净工作台上把已冲洗干净 的外植体浸入70-75%酒精中消毒Imin ； (5)用无菌水浸泡不断摇动冲洗3 4次；(6)最 后浸入0. 升汞或2%次氯酸钠溶液灭菌6-12min，其间不断摇动；(7)然后用无菌水冲洗 后，用无菌滤纸吸干表面水分，即可用于接种。外植体一般使用乙醇浓度70% 75%。这一浓度范围的乙醇具有较强的穿透力 和杀菌力。利用乙醇处理材料时，一般不超过30s。用乙醇处理外植体，除了有外植体体表 灭菌的作用外，还有浸润组织材料的作用。许多植物的外植体都需要先通过乙醇的浸润，然 后再使用其他药品作进一步灭菌。由于竹类植物表皮细胞具有非常致密的乳突，尘埃及各种菌类的孢子嵌着在乳突间的缝隙内。乳突表面有一层蜡质状的物质，表皮细胞还具有较 厚的角质层，这些都阻碍了消毒液的渗透。因此在用酒精进行消毒前还要先用洗洁精进行 浸泡，使里面蜡质状物质溶化。且用乙醇消毒时间延长到Imin才能很好地浸润组织。本专利技术使用升汞浓度为0. 1%，并在实验基础上提出处理时间。经过升汞处理过的 材料，由于升汞在外植体表面的残留会导致外植体在培养过程中的坏死，甚至使培养失败。 所以必须在升汞处理之后，用无菌水冲洗干净，一般要冲洗5次以上，才可以保证外植体表 面的残留升汞很少。本专利技术用2%次氯酸钠同样在实验基础上提出处理时间，处理后的外植体同样要 用无菌水冲洗3 4次。实验证明当步骤(5)酒精浓度为75%时，步骤(6)灭菌处理用0. 升汞处理外 植体lOmin，在MS培养基中，接种成活率最高，低于或高于lOmin，接种成活率都会降低。当步骤(5)酒精浓度为75%时，步骤(6)灭菌处理用2%次氯酸钠处理外植体 IOmin,在MS培养基中，接种成活率最高，低于或高于lOm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法，其特征是：消毒流程按下列步骤进行，（１）将小蓬竹生长健壮的半木质化枝条作外植体，用１％洗洁精溶液完全浸泡３０ｍｉｎ，（２）用自来水浸泡３０ｍｉｎ；（３）用流水冲洗至无泡沫产生为止，用滤纸吸干表面水分；（４）在超净工作台上把已冲洗干净的外植体浸入７０－７５％酒精中消毒１ｍｉｎ；（５）用无菌水浸泡不断摇动冲洗３～４次；（６）最后侵入０．１％升汞或２％次氯酸钠溶液灭菌６－１２ｍｉｎ，其间不断摇动；（７）然后用无菌水冲洗后，用无菌滤纸吸干表面水分，即可用于接种。

【技术特征摘要】
一种小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法，其特征是消毒流程按下列步骤进行，(1)将小蓬竹生长健壮的半木质化枝条作外植体，用1％洗洁精溶液完全浸泡30min，(2)用自来水浸泡30min；(3)用流水冲洗至无泡沫产生为止，用滤纸吸干表面水分；(4)在超净工作台上把已冲洗干净的外植体浸入70 75％酒精中消毒1min；(5)用无菌水浸泡不断摇动冲洗3～4次；(6)最后侵入0....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘济明，李敏进，何绪，孙运刚，徐国瑞，徐雪娇，廖小锋，张东凯，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：52[中国|贵州]